«Роль NMDA - рецепторов глутамата в регуляции дифференциации интерлейкин - 17 - продуцирующих CD4+ T - клеток при рассеянном склерозе» - Дипломная работа

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ПАТОГЕНЕЗ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 8

1.1. Рассеянный склероз 8

1.2. Роль Th17-клеток в иммунопатогенезе рассеянного склероза 14

1.3. Транскрипционный фактор RORYt и дифференциации Th17 клеток 21

1.4. Рецепторы глутамата и их участие в функционировании иммунных клеток при рассеянном склерозе 26

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 31

2.1. Материалы исследования 31

2.1.1. Объект исследования 31

2.1.2. Клинико-демографическая характеристика доноров 31

2.1.3. Перечень использованных реактивов 32

2.2. Методы исследования 34

2.2.1. Забор крови/биоматериала 34

2.2.2. Выделение лимфоцитов периферической крови 34

2.2.3. Культивирование лимфоцитов периферической крови 35

2.2.4. Иммунофенотипирование лимфоцитов 36

2.2.5. Внутриклеточное иммуноцитохимическое окрашивание цитокина IL-17A 36

2.2.6. Выделение суммарной РНК 37

2.2.7. Синтез комплиментарной ДНК (кДНК) с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы 37

2.2.8. Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени 38

2.2.9. Методы статистического анализа результатов исследования 40

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 41

3.1. Влияние (+)-МК801 на содержание CD4+ Т-клеток у здоровых доноров и доноров - больных рассеянным склерозом

3.2. Эффект блокады NMDA-рецепторов на содержание IL-17-продуцирующих CD4+ Т-клеток у здоровых доноров и доноров - больных рассеянным склерозом

3.3. Влияние (+)-MK801 на экспрессию гена транскрипционного фактора RORYt, специфичного для Th17 клеток, у здоровых и больных рассеянным склерозом доноров

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ «БИОЛОГИЯ» 41

4.1. Значение биологического образования 41

4.2. Анализ программ и учебников по реализации материалов ВКР в школе 43

4.3. Разработка урока по теме: «Иммунитет. Нарушения иммунной системы

человека. Вакцинация» для 8 класса 47

4.4. Применение логико-смысловой модели в образовательном процессе (педагогические методы) 53

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 57

ВЫВОДЫ 58

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 59

ПРИЛОЖЕНИЕ 75

Введение

В настоящие время рассеянный склероз является одним из распространённых заболеваний в современном обществе,

характеризующиеся как хроническое аутоиммунное демиелинизирующее нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы (Бойко, 2008). Рассеянный склероз является причиной серьезной инвалидности у молодых людей в трудоспособном возрасте. До сих пор не удалось установить ключевой фактор, вызывающий развитие РС, поэтому принято рассматривать его как мультифакториальное заболевание, имеющее полигенную природу (Гусев,1992; Sospedra et al., 2005).

Установлено, что возможными причинами срыва иммунологической толерантности и аутоиммунной реактивности при РС являются нарушение функций, дифференцировки, а также изменение субпопуляционного баланса эффекторных CD4+ Т-лимфоцитов (Kuchroo et al., 2012; Raphael et al., 2014). На данный период времени интенсивно изучается функциональная значимость в инициации, формировании, прогрессии и ремиссии РС IL-17-продуцирующих CD4+ Т-клеток (Th17) (Jadidi-Niaragh et al., 2011). Процесс терминальной дифференциации CD4+ Т-лимфоцитов в эффекторные клетки в значительной степени определяется активностью транскрипционных факторов (ТФ), а формирование «провоспалительных» Th17 клеток регулируется транскрипционным фактором RORYt (Basu et al., 2013). Ретиноевый орфан-рецептор гамма (RORYt) представляет собой ядерный рецептор, который избирательно экспрессируется различными лимфоцитами и имеет решающее значение для развития вторичных и третичных лимфоидных органов, а также для развития Т-клеточных субпопуляций. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют о том, что большое значение в формирование патологического процесса в мозге при РС имеет избыточная продукция провоспалительных цитокинов на фоне уменьшения количества противовоспалительных цитокинов, что приводит к нарушению баланса между субпопуляциями Т-лимфоцитов и смещению в 5

сторону провоспалительных клеток (Hollifield et al., 2003; Mikulkova et al., 2010).

Согласно данным последних исследований, в разрушении миелина, гибели нейронов и олигодендроцитов, а также воспалении в ЦНС при РС может принимать участие нейромедиатор глутамат как непосредственно (гиперактивация NMDA - рецепторов на нейронах, запуск эксайтотоксических процессов, которые является причиной многих заболеваний центральной нервной системы, в том числе и рассеянного склероза), так и через влияние на его рецепторы, экспрессирующиеся на поверхности T - клеток (Зайнуллина, 2011; Ganor et al., 2012). Так показано, что рецепторы Глу NMDA подтипа участвуют в регуляции секреции цитокинов Т - клетками, поляризации субпопуляций Т-хелперов, контроле пролиферации, апоптоза, миграции и адгезии. Однако молекулярные механизмы регуляции ионотропными рецепторами глутамата функций иммунокомпетентных клеток при данном заболевании практически не изучены.

Таким образом, РС является важной проблемой современного общества, а исследование патогенетических процессов и их взаимосвязей при данной патологии является на сегодняшний день крайне актуальным.

Исходя из выше сказанного целью исследования стало изучение участия NMDA - рецепторов глутамата в регуляции дифференциации IL-17-продуцирующих CD4+ Т - клеток при рассеянном склерозе.

Задачи:

1. Охарактеризовать влияние блокады NMDA-рецепторов на содержание CD4+ субпопуляции Т - лимфоцитов у здоровых лиц и больных рассеянным склерозом;

2. Изучить вовлеченность NMDA - рецепторов в регуляции продукции провоспалительного цитокина IL - 17 CD4+T - клетками, полученными от здоровых лиц и больных рассеянным склерозом;

3. Выявить влияние блокады NMDA - рецепторов на экспрессию мРНК гена транскрипционного фактора RORYt;

4. Разработка методических рекомендаций по внедрению данных исследования в программу школьного курса биологии.

Научная новизна работы. Новизна работы заключается в том, что были получены данные о роли NMDA - рецепторов Т - лимфоцитов в иммунопатогенезе РС. Установлена вовлеченность глутаматных рецепторов NMDA подтипа в регуляцию дифференцировки и поддержание баланса эффекторной субпопуляции IL-17-продуцирующих CD4+ Т-лимфоцитов при РС. Установлена взаимосвязь между блокадой NMDA - рецепторов и содержанием Th17 лимфоцитов у больных РС. Впервые показано ингибирующее действие неконкурентного антагониста NMDA-рецепторов на экспрессию цитокина IL - 17 и гена транскрипционного фактора RORYt при РС.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты указывают на участие глутаматных рецепторов NMDA подтипа в регуляции функции Т- клеток, что подтверждает их вовлеченность в развитие

иммунопатологических процессов при РС. Кроме того, позволяют рассматривать данные рецепторы в качестве возможной мишени для фармакотерапевтической коррекции РС и других аутоиммунных демиелинизирующих заболеваний.

Апробация. Материалы выпускной квалификационной работы были представлены на XIII всероссийской (87-итоговой) студенческой научно-практической конференции с международным участием «СТУДЕНЧЕСКАЯ НАУКА И МЕДИЦИНА: ТРАДИЦИИ, ИННОВАЦИИ И ПРИОРИТЕТЫ» (9-12 апреля 2019 г., Самара). Тезисы опубликованы в сборнике данной

конференции.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии Института биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук.

Выдержка из текста работы

ГЛАВА 1. ПАТОГЕНЕЗ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Рассеянный склероз

Рассеянный склероз (РС) представляет собой многокомпонентное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, характеризующееся воспалительными клеточными инфильтратами и демиелинизацией, сопровождающееся гибелью олигодендроцитов и нейронов (Lassmann et al., 1998).

Во всём мире около 2,5 млн. человек страдают РС, хроническим нейровоспалительным заболеванием головного и спинного мозга, являющимся причиной серьёзной инвалидности у молодых людей, особенно женщин. Средний возраст начала заболевания составляет 30 лет - время для овладения профессиональных навыков и планирования семьи. Через 25 лет после постановки диагноза примерно 50% пациентов нуждаются в постоянном использовании инвалидной коляски. Симптоматика заболевания характеризуется нарушениями сенсорных, зрительных, моторных систем (Frischer et al., 2009). Изменение клинических проявлений коррелирует с пространственно-временным распространением очагов поражения в ЦНС (Mayo et al., 2014). Эти поражения являются признаком РС и вызваны проникновение иммунных клеток через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который способствует воспалению, демиелинизации, глиозу и нейроаксональной дегенерации, что приводит к нарушению нейронального сигнала (Feinstein et al., 2015).

Точная причина РС неизвестна, но установлены эндогенные и экзогенные факторы, влияющие на развитие заболевания. Один из эндогенных факторов - это генетическая предрасположенность индивидуума. Большинство генов - кандидатов, ассоциированных с РС, оказалось, вовлечены в функционирование иммунной системы. На сегодняшний день генетические детерминанты развития заболевания остаются не до конца изученным. Большое количество литературных данных указывает на нарушения в центральных механизмах толерантности, а также периферические изменения в эффекторных функциях Т-клеток (например, в продукции цитокинов, пролиферации), которые влияют на предрасположенность к рассеянному склерозу (Schattling et al., 2012).

Экзогенными факторами, влияющими на инициацию РС, являются факторы окружающей среды. На сегодняшний день известные экологические факторы, связанные с РС, включают уровень витамина D, наличие цитомегаловирусной инфекции у человека, циркадные нарушения и др (Kearney et al., 2015).

В настоящее время применяемые для фармакокоррекции РС иммуномодулирующие препараты способны снижать активность

аутореактивных иммунных клеток и проницаемость ГЭБ, тем самым эффективно уменьшая частоту рецидивов, но при этом наблюдаются значительные побочные эффекты: развитие других аутоиммунных

заболеваний, злокачественные новообразования и т.д. Таким образом, существует необходимость выявления более конкретных терапевтических мишеней, при воздействии на которые, будут наблюдаться максимальная эффективность и минимальные побочных реакции (Calliope et al., 2015).

По общей симптоматике пациентов выявили несколько подтипов болезни. Наиболее распространенной формой, затрагивающей приблизительно 85% пациентов, является - рецидивирующий ремитирующий РС (РРРС). Он характеризуется неврологической дисфункцией с последующим периодом ремиссии. Рецидивы совпадают с воспалением ЦНС и демиелинизацией, при использовании магнитнорезонансной томографии головного мозга наблюдается поражение белого вещества. Примерно у 80% пациентов продолжает развиваться вторичный прогрессирующий РС (ВПРС). Данная форма заболеваний сопровождается атрофией ЦНС; то есть снижение объема мозга и увеличение потери аксонов.

Приблизительно у 10% пациентов с РС диагностируется первичное прогрессирующее заболевание (ППРС) (Calliope et al., 2015).

Патология РС характеризуется бляшками или поражениями головного и спинного мозга, указывающие на потерю миелиновых оболочек и олигодендроцитов (рис. 1). При раннем РС аксоны и нейроны в основном сохраняются, но длительный период заболевания приводит к постепенной гибели нейронов, аксональныму повреждению и увеличению желудочков мозга. Астроциты образуют множественные склеротические глиальные шрамы, которые могут частично восстанавливаться путем ремиелинизации белого вещества. Демиелинизация также встречается в сером веществе коры, ядер и спинного мозга. При этом воспаление присутствует на всех стадиях рассеянного склероза. При поражениях головного мозга отмечается нарушение гематоэнцефалического барьера. При длительном течении заболевания происходит активация микроглии и астроцитов, диффузное сокращение миелина и повреждение аксонов, что приводит к более выраженной атрофии головного мозга (Chard et al.,2002; Popescu, 2012).

Заключение

В данной выпускной квалификационной работе проведено исследование функциональной значимости NMDA-рецепторов Т-клеток при рассеянном склерозе.

В результате проведенной работы нами было установлено, что блокада NMDA-рецепторов не влияет на содержания CD4+ субпопуляции Т - лимфоцитов как у здоровых лиц, так и у больных рассеянным склерозом.

В ходе исследования было установлено, что у здоровых и у больных РС блокада NMDA-рецепторов оказывает ингибирующее действие на продукцию цитокина IL-17 посредством дифференциальной модуляции активности транскрипционного фактора RORYt, причем эффект блокады более выражен в отношении клеток, полученных от больных РС.

Установленные особенности регуляции NMDA-рецепторами функций Т-клеток, полученных из крови больных РС, свидетельствует о том, что данный тип рецепторов играет важную роль в иммунопатогенезе РС.

Таким образом, полученные нами сведения способствуют углублению знаний о патогенетических механизмах развития и прогрессирования РС и позволяют определить роль NMDA-рецепторов в данных процессах. Кроме того, результаты исследования указывают на возможность рассматривать данный подтип глутаматных рецепторов в качестве мишени для фармакологической коррекции при данной патологии.

Список литературы

1. Биология // Энциклопедический словарь Брокгауза и Ефрона: В 86 томах (82 т. и 4 доп.). — СПб., 1890—1907

2. Болдырев, А.А. NMDA-рецепторы в клетках иммунной системы / А.А. Болдырев, Е.А. Брюшкова, Е.А. Владыченская // Биохимия. - 2012. - V. 77.-С. 160-168. 14/1.4.

3. Верзилин Н. М. и Корсунская В. М. Общая методика преподавания биологии. Учебник для студентов биол. фак. пед. ин-тов. Изд. 3-е. М., «Просвещение», 1976.

4. Гусев, Е.И. Клинико-иммунологический мониторинг состояния больных рассеянным склерозом / Е.И. Гусев, Т.Л. Демина, А.Н. Бойко, М.Ю. Татаринова // Ж.невр. и псих. - 1992. -Т. 2. - C. 14 -18. 12введ

5. Зайнуллина, Л.Ф. NMDA-рецепторы - возможные компоненты депозависимого входа Ca{2+} в Т-лимфоциты человека [Текст] / Л.Ф. Зайнуллина, Р.С. Ямиданов, Вахитов В.А., Вахитова Ю.В. // Биохимия. - 2011. - Т. 76. -№ 11. - С. 1517-1524.

+ еще 139 источников

Примечания

Оригинал в pdf