«ЧАСТИЕ ГЛУТАМАТНЫХ NMDA-РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОДУКЦИИ ИЛ-10 И ФНОа Т-ЛИМФОЦИТАМИ ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ» - Дипломная работа

Содержание

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ПАТОГЕНЕЗ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА 9

1.1 Эпидемиология и этиология рассеянного склероза 9

1.2 Иммунопатогенез рассеянного склероза 11

1.2.1 Роль провоспалительного цитокина ФНОа в иммунопатогенезе рассеянного склероза 17

1.2.2 Участие противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в иммунопатогенезе рассеянного склероза 18

1.3 Глутаматные рецепторы NMDA-подтипа и рассеянный склероз 22

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 27

2.1. Материалы исследования 27

2.1.1 Объект исследования 27

2.1.2 Клинико-демографическая характеристика доноров 27

2.2. Методы исследования 28

2.2.1 Забор крови/биоматериала 28

2.2.2 Выделение лимфоцитов периферической крови 28

2.2.3 Культивирование лимфоцитов периферической крови 29

2.2.4 Количественное определение цитокинов с помощью иммуноферментного анализа 30

2.2.5 Выделение суммарной РНК 30

2.2.6 Синтез комплиментарной ДНК (кДНК) с помощью РНК-зависимой ДНК- полимеразы 31

2.2.7 Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени 32

2.2.8 Статистическая обработка результатов исследования 33

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 34

3.1 Влияние блокады NMDA-рецепторов на экспрессию мРНК гена TNFAT- клетками здоровых и больных доноров

3.2 Вовлеченность NMDA-рецепторов в регуляцию продукции провоспалительного цитокина ФНОа Т-клетками здоровых доноров и больных РС

3.3 Эффект блокады NMDA-рецепторов на экспрессию мРНК гена CSIF в Т- клетках, полученных от здоровых лиц и больных РС

3.4 Роль NMDA-рецепторов в регуляции продукции ИЛ-10 здоровых доноров и лиц, больных РС

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ «БИОЛОГИЯ» 34

4.1. Значение биологического образования 34

4.2. Анализ программ и учебников по реализации материалов ВКР 35

4.3. Разработка урока по теме: «Кровь и остальные компоненты внутренней среды организма» для 8 класса 40

4.4. Применение логико-смысловой модели в образовательном процессе (педагогические методы) 46

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 49

ВЫВОДЫ 50

СПИСОК НАУЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 52

ПРИЛОЖЕНИЕ 63

Введение

Одной из актуальных проблем современной неврологии является заболевание рассеянный склероз (РС). Медико-социальная значимость данной патологии обусловлена тем, что она поражает людей в возрасте от 16 до 55 лет, которые ведут активную социально-трудовую деятельность, и приводит уже через 10 - 15 лет к их инвалидизации (Гусев и др., 2003). Кроме того, основной целью применяемых лекарственных средств является устранение симптомов и замедление прогрессирования патологии, однако их использование в ряде случаев неэффективно, а в ряде - сопровождается серьезными негативными побочными эффектами и требует тщательного врачебного контроля (Бойко и др., 2009, Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова С.С., 2018).

В целом РС представляет собой хроническое прогрессирующее воспалительное аутоиммунное нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы. Сопровождается оно преимущественно очаговой неврологической симптоматикой, которая включает расстройства зрительной системы, нарушения со стороны функций тазовых органов, а также когнитивные нарушения и др. Клинические проявления, тип и скорость прогрессирования патологии варьируют в широком диапазоне и зависят от многих факторов, в том числе от расположения и степени повреждения нервов. Следует отметить, что имеющиеся на сегодняшний день знания о РС не позволяют однозначно прогнозировать его развития и течение. Патоморфологические проявления заключаются в образовании очагов воспаления в белом веществе головного и/или спинного мозга с демиелинизацией (разрушение миелиновых оболочек нервов), аксональной дегенерацией и лимфоидной инфильтрацией периферических Т- клеток (GAMES, 2003, Hollifield et al., 2003, Kurtzke, 2000).

Рассеянный склероз - мультифакториальное полигенное заболевание с достаточно сложным и до конца неизученным патогенезом. Установлено, что ведущую роль в запуске патологического процесса при РС играют аутоиммунные механизмы, ведущие к развитию нейровоспаления и разрушению миелина нервов. Большое значение в формировании патологического процесса при РС отводится 5

дисбалансу в системе цитокинов, обеспечивающей взаимодействие между клетками при развитии иммунного ответа, а именно избыточной продукции провоспалительных цитокинов (ФНОа), сопровождающейся подавлением выработки противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10) (Hollifield et al., 2003, Kallaur et al., 2013, Mikulkova et al., 2010).

В последние годы отмечается повышенное внимание исследователей к регуляции механизмов связи между иммунной и нервной системами при данном заболевании. В литературе имеется множество данных, подтверждающих роль глутаматэргической системы в патологических процессах при РС, вследствие запуска эксайтотоксической программы, что вносит вклад в поддержание нейродегенерации при РС. Сообщается также о том, что нейромедиатор глутамата проявляет иммуномодулирующее действие, реализующееся на уровне периферических Т-лимфоцитов посредством связывания с рецепторами на их поверхности, в частности ионотропными NMDA-рецепторами (Imitola et al., 2005, Levite, 2017), однако механизмы этого действия нуждаются в дальнейших исследованиях.

Таким образом, РС остается важной медико-социальной проблемой. Исследование патогенетических процессов, характерных для данного заболевания, и поиск новых фармакомишеней и способов их коррекции является чрезвычайно актуальным медико-биологическим направлением.

Исходя из выше сказанного, целью выпускной квалификационной работы стало выявление участия NMDA-рецепторов, локализованных на периферических Т-клетках, полученных от здоровых лиц и больных РС, в регуляции продукции фактора некроза опухоли а (ФНО а) и интерлейкина-10 (ИЛ-10).

Задачи, поставленные для достижения цели:

1. Охарактеризовать влияние блокады NMDA - рецепторов на экспрессию мРНК гена TNFA, кодирующего ФНОа, в Т-клетках, полученных от здоровых лиц и больных РС;

2. Оценить вовлеченность NMDA - рецепторов в регуляцию продукции провоспалительного цитокина ФНОа Т-клетками, полученных от здоровых лиц и больных РС;

3. Выявить эффекты блокады NMDA - рецепторов на экспрессию мРНК гена CSIF, кодирующего ИЛ-10, в Т-клетках, полученных от здоровых лиц и больных РС;

4. Изучить роль NMDA - рецепторов в регуляции продукции ИЛ-10 у здоровых лиц и больных РС;

5. Разработка методических рекомендаций по использованию теоретического материала в школьном курсе биологии.

Научная новизна работы. В ходе проведенного исследования впервые установлена вовлеченность NMDA-рецепторов глутамата в регуляцию выработки провоспалительных (ФНОа) и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов Т- лимфоцитами при РС. Показано, что экспрессия генов исследуемых цитокинов ингибируется вследствие блокады NMDA-рецепторов антагонистом (+)-МК801. По сравнению со здоровыми донорами у пациентов с РС негативный эффект рецепторной блокады менее выражен.

Практическое значение. Результаты исследования раскрывают возможные механизмы, с помощью которых реализуется иммуномодулирующее действие глутамата, а также указывают на возможность использования ионотропных NMDA-рецепторов как мишень для фармакотерапевтической коррекции при изучаемой патологии.

Апробация. Результаты исследования были представлены на XIII Всероссийской (87-ой Итоговой) студенческой научной конференции с международным участием «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты». Тезис опубликован в материалах конференции.

По содержанию дипломной работы была опубликована статья в сборнике научных статей, посвященный Н.И. Вавилову «Вавиловские чтения - 2018», 28 ноября - Уфа, издательство БГПУ, 2018.

Выпускная квалификационная работа выполнена в лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии Института биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук.

Выдержка из текста работы

ГЛАВА 1. ПАТОГЕНЕЗ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

1.1 Эпидемиология и этиология рассеянного склероза

Согласно данным ВОЗ за 2018 год, в мире насчитывается около 3 миллиона человек с рассеянным склерозом. Следует отметить, что в последние годы наблюдается неуклонный рост заболеваемости и распространенности РС в мире. По данным Международной Федерации больных рассеянным склероз (MSIF - Multiple Sclerosis International Federation), в 2008 году число людей, страдающих данным заболеванием, увеличилось с 2,1 миллиона до 2,3 миллионов в 2013 году, то есть с 30 до 33 случаев на 100.000 населения (MSIF, 2018).

В России распространенность заболевания варьируется от 20 до 60 случаев на 100.000 населения в различных регионах, общее число больных РС насчитывает около 200 тысяч человек. На сегодняшний день остается актуальным изучение эпидемиологами показателей РС в крупных промышленных мегаполисах. Проведенное в городе Уфа исследование рассеянного склероза в 2010-2016 годах, показало достоверное повышение распространенности заболевания с 34,5 до 46,5 на 100.000 населения и снижение показателей смертности и первичной инвалидности (Хайбуллин и др., 2010).

Для данного заболевания характерна ранняя инвалидизация больных. Известно, что при отсутствии адекватного своевременного лечения, в среднем через 10 лет до 50% пациентов с диагнозом РС будут иметь затруднения в выполнении профессиональных функций, через 15 лет более 50% - проблемы с подвижностью, походкой, а при длительности более 20 лет - трудности в самообслуживании (Ascherio, A. et al, 2007).

Клинико-эпидемиологические исследования показывают, что женщины в среднем болеют РС в 2.5-3 раза чаще, чем мужчины. Исследователи отмечают, что данная диспропорция возрастает от года к году (Asadullah et al.,2003, Hafler, 1999).

Вопреки интенсивным исследованиям в области молекулярной биологии, нейрохимии, иммунологии и генетики, в настоящее время нет четкого понимания

этиологии рассеянного склероза. Сообщается, что на риск развития РС могут влиять различные экзогенные и эндогенные факторы, такие как географическая зона проживания, факторы окружающей среды, пол, возраст этническое происхождение, а также наличие генетической предрасположенности.

Данная патология встречается практически во всех этнических группах (Малкова и др., 2006). Многие исследователи отмечают расширение возрастного диапазона и выявление заболевания в «атипичных» этнических группах (Хусаинова, 2012).

Доказано, что в развитии заболевания играют роль экологические и географические факторы, такие как, например, недостаточная инсоляция, а также стресс и некоторые интоксикации (Chung, 2005, Goldsby, 2003, Hafler, 1999, Werner et al., 2001). Все больше данных свидетельствуют о том, что витамин D играет важную роль в развитии РС. Низкий уровень витамина D в крови был определен как фактор риска развития РС. Считается, что высокий уровень естественного витамина D поддерживает функцию иммунной системы и может помочь защитить организм от иммуноопосредованных заболеваний, в частности РС. Однако корреляция между уровнем витамина D и риском развития данной патологии требует дальнейшего исследования.

Рассматриваемая патология не является наследственным заболеванием, однако, существование наследственной предрасположенности к этому заболеванию было выявлено в результате эпидемиологических, популяционных и близнецовых исследований. Описаны семейные случаи РС, составляющие в разных популяциях 5 - 7 % от общего числа больных. Установлено увеличение риска развития РС у родственников первой степени (родители, братья, сестры) (Barcellos et al., 2002; Willer et al., 2003; Ebers et al., 2004). Конкордантность РС составляет 31 % среди монозиготных близнецов, что в 6 раз выше частоты

заболевания среди дизиготных близнецов (5 %) (Sadovnick et al., 1993; Zuvich et al., 2009). Большинство работ, посвященных изучению генетических факторов РС, указывают на то, что заболевание развивается вследствие независимого действия, либо взаимодействия множества генов, каждый из которых вносит небольшой 10

вклад в развитие болезни. Идентифицировано около 200 генов, коррелирующие с риском развития РС (Dyment et al., 2004; Forte et al., 2006; Столяров и др., 2008; Zuvich et al., 2009).

Известно, что некоторые вирусы способны напрямую повреждать олигодендроциты и миелин, запускать аутоиммунные реакции по механизмам молекулярной мимикрии, вызывать поликлональную активацию

иммунокомпетентных клеток (Ascherio et al., 2007; Compston et al., 2008). В последние годы особое внимание уделяется изучению роли вируса Эпштейна- Барр (ВЭБ), вызывающего мононуклеоз, в инициации РС. Кроме того, согласно литературным данным на пролиферацию аутореактивных Т-лимфоцитов при РС могут влиять ранее считавшиеся совершенно безвредными вирусы: TTV (Torque Teno virus) и TLMV (TTV - like mini virus). Однако эти сведения требуют дальнейшего изучения (Komijani M. et al, 2011).

Исходя из вышеуказанного, следует, что РС является социально и экономически значимым заболеванием, важность исследования которого возрастает в связи с увеличением количества пациентов с данной патологией. Клинический полиморфизм, а также характер течения РС зависят от сочетания и взаимодействия как внутренней, так и внешней среды, образа жизни. Тем не менее, известные к настоящему времени теоретические, клинические и экспериментальные данные о РС не могут обеспечить точного прогнозирования его развития и прогрессирования. В связи с этим требуются дальнейшие исследования данной патологии.

Заключение

В данной выпускной квалификационной работе проведено исследование участия NMDA-рецепторов в регуляции продукции цитокинов Т-клетками при рассеянном склерозе.

Инициирование и прогрессирование аутоиммунного процесса при РС обусловлено дисрегуляцией продукции цитокинов иммунными клетками и их баланса. В связи с этим было изучено влияние блокады данного типа рецепторов глутамата неконкурентным антагонистом (+)-МК801 на синтез и секрецию ФНОа и ИЛ-10 Т-клетками у больных РС и здоровых лиц. Согласно полученным данным, в обеих экспериментальных группах на фоне блокады рецепторов наблюдалось снижение содержания цитокинов в среде культивирования и ингибирование экспрессии соответствующих генов в Т-лимфоцитах. Следует отметить, что (+)-MK801 приводит к изменению исследуемых показателей только в условиях активации клеток. Было также установлено, что цитокиновый ответ стимулированных Т-клеток на блокаду NMDA-рецепторов у больных РС по сравнению со здоровыми донорами менее выражен.

Таким образом, результаты проведенного нами исследования, позволили определить функциональную вовлеченность NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов в регуляцию продукции про- и противовоспалительных цитокинов, реализуемую на уровне мРНК генов соответствующих белков у здоровых лиц и у больных РС. Выявленные особенности регуляции NMDA-рецепторами функций Т-клеток, полученных из крови больных РС, указывают на важность данного типа рецепторов в иммунопатогенезе заболевания, что позволяет рассматривать данный подтип глутаматных рецепторов в качестве потенциальной мишени для разработки новых средств коррекции данной патологии. Кроме того, способствуют расширению наших знаний о нейроиммунных взаимодействиях и патогенетических механизмах при РС.

Список литературы

1. Бойко, А.Н. Механизмы развития нейродегенеративного процесса при рассеянном склерозе - нейропротективное влияние препаратов бета- интерферона сегодня и нейротрофические факторы завтра / А.Н. Бойко, С.В. Петров, В.А. Нестерова // Журн. Неврол. и психиат. Приложение «Рассеянный склероз». - 2003. - С. 83-90.

2. Бойко, А.Н. Патогенетическое лечение рассеянного склероза: настоящее и будущее / А. Н. Бойко [и др.] // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. - 2009. - № 7. - С. 90-99.

3. Гусев Е.И., Бойко А.Н., Завалишин И.А. Эпидемиологическое исследование рассеянного склероза. Методические рекомендации МЗ РФ N 2003/82. Москва 2003. 80 с.

4. Гусев Е.И., Завалишин И.А., Бойко А.Н. Рассеянный склероз. М.: Реал Тайм, 2011.

5. Гусев Е.И., Завалишин И.А., Бойко А.Н. Рассеянный склероз: Клиническое руководство. М.: Реал Тайм, 2011

+ еще 98 источников

Примечания

Оригинал в pdf