«Разработка метода определения антител, нейтрализующих вирус бешенства, в сыворотках крупного рогатого скота» - Дипломная работа

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ИСТОРИЧЕСКИЕ И СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ ПРОБЛЕМЫ БЕШЕНСТВА (обзор литературы) 8

1.1. История 8

1.2. Морфология 11

1.3. Устойчивость вируса 14

1.4. Патогенез 14

1.5. Виды культур клеток для культивирования вируса бешенства 15

1.6. Методы определения антител к вирусу бешенства 17

1.7. Заключение 22

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ 24

2.1. Материалы исследования 24

2.2. Методы исследования 26

2.2.1. Проведение реакции нейтрализации 26

2.2.2. Постановка ИФА 30

ГЛАВА З.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 34

3.1. Подбор условий проведения анализа 34

3.1.1. Определение длительности культивирования вируса 34

3.1.2. Определение концентрации КК 34

1.1. Выявление ВНА к ВБ 35

3.3. Определение титра ВНА к ВБ с помощьюИФА 36

3.4. Интерпретация результатов 39

Глава 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МАТЕРИАЛА ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ «БИОЛОГИЯ» 40

3.5. Значение и роль биологического образования 40

4.2. Анализ тематического планирования 42

4.3. Применение материалов ВКР в школьном курсе 43

4.3.1. Разработка урока на тему «Иммунитет. Иммунная система», 8 класс 43

4.4. Использование ЛСМ в процессе биологического образования 49

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 52

ВЫВОДЫ 53

Библиографический список 54

Приложение 1 59

Приложение 2 60

Введение

Актуальность. Бешенство во всем мире является эндемическим, смертельным, вирусным энцефалитом, который продолжает оставаться одной из основных проблем общественного здравоохранения и ветеринарии во многих частях мира. По оценкам, бешенство является запущенной, смертельной болезнью, которая ежегодно приводит к более чем 50000 смертей людей и животных (ВОЗ). Одним из важнейших элементов эффективного контроля над бешенством человека является использование антирабических вакцин.

В мире от бешенства ежегодно погибают десятки тысяч человек. По данным Россельхознадзора, за январь — февраль 2018 года было зафиксировано 578 случаев бешенства у животных. А за январь — февраль 2017-го — в 2 раза меньше (273). Больше всего случаев — в Волгоградской, Липецкой, Саратовской, Тульской, Белгородской, Кировской областях и в Бурятии. Тем не менее, 99% случаев инфицирования — от бешеных собак. За рубежом в большинстве случаев встречается в Азии и Африке.

Бешенство (Rabies)- острое зоонозное, вирусное прогрессирующее заболевание млекопитающих, в том числе человека, которое характеризуется продолжительным инкубационным периодом с последующим поражением центральной нервной системы, энцефаломиелитами, гиперемии, параличами и неизбежной летальностью. Вирус, вызывающий бешенство, относится к группе миксовирусов рода Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Все лиссавирусы являются нейротропными инфекционными агентами, способные подорвать любой иммунный ответ хозяина, который установлен, и, таким образом, исход инфекции является фатальным почти в 100% случаев.

Вирус бешенства передается человеку со слюной больного животного через укус, далее из мышечной ткани, достигнув нервных окончаний, вирус начинает распространяться центростремительно по центральной нервной 5

системе, вызывая острый прогрессирующий энцефалит со смертельным исходом. В зависимости от места укуса, инкубационный период длится в среднем от 15 до 45 суток, а скорость продвижения вируса составляет около 8 см в день (S. Gluska, E.E. Zahavi, M. Chein, 2014). Бешенство, как правило, не распространяется от человека к человеку — хотя очень редко, он может распространяться от одного человека к другому во время трансплантации органов. Также возможна вертикальная передача вируса от матери, укушенной животным, ребенку.

На сегодняшний день единственным способом предотвратить заболевание и последующий летальный исход является своевременное введение антирабической вакцины пациенту. Вакцина против бешенства способна стимулировать высокий уровень вируснейтрализующих антител.

Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейтрализующих антител является индикатором эффективности вакцинации, так как только вируснейтрализующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции (В. Dietschold, М. Lafon, 1990). Для выявления антител к вирусу бешенства необходима точная и быстрая диагностика. Из-за того, что титр АТ в изучаемых сыворотках невысокий, то стандартная РН не подходит.

Цель: разработка метода, позволяющий выявить наличие

вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках КРС.

Задачи:

- подбор оптимальных условий проведения анализа;

- выявление наличия антител, нейтрализующих вирус бешенства, в различных сериях сывороток КРС на культуре клеток с помощью РН;

- определение титр антител к вирусу бешенства в исследуемых сыворотках с помощью ИФА;

- интерпретация результатов исследования;

- разработка методических рекомендаций по использованию результатов исследования в курсе «Биология».

Научная новизна: впервые использован метод ИФА для культуральных жидкостей. При работе с разработанным методом нет субъективности в оценке, что присуще ФИТЦ-антителам. Кроме того, предложенный метод отличается от стандартной РН тем, что не требует дорогостоящего флуоресцентного микроскопа, который требует технического обслуживания, квалифицированного персонала для интерпретации теста.

Практическая значимость: использование в качестве субстрата для опыта культур клеток значительно снижает трудозатраты, которые присуще при работе с лабораторными животными. Метод на основе культур клеток считается достойной альтернативой традиционному методу на мышах по ВОЗ и не уступает ему по своей чувствительности и более контролируем. Ввиду биоэтических проблем использование лабораторных животных для экспериментов контролируется 3И-стратегией, цель которой заменить животных на модели.

Апробация: по вопросам изучения вируса бешенства и современных методах диагностики была опубликована статья в международном научном журнале «Colloquium» (Варшава, 2019, выпуск №13 (37), входящий в

перечень РИНЦ.

Выдержка из текста работы

ГЛАВА 1. ИСТОРИЧЕСКИЕ И СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ ПРОБЛЕМЫ БЕШЕНСТВА (обзор литературы)

1.1. История

Бешенство, один из старейших и самых опасных зоонозных болезней, известных человечеству.

Впервые это заболевание подробно описано Демокритом в V веке до н. э. В IV веке до н.э. - Аристотель впервые описывает бешенство животных, а в 1 в. н.э. о заболевании людей упоминает римский врач Корнелий Цельз, назвав его водобоязнью.

Далее в 1801 г. была доказана возможность передачи болезни со слюной больного животного. После этого начались опыты Луи Пастера и его учеников Э. Ру и Ш. Шамберлан в Париже. В 1881 г. ими было установлено, что возбудитель ВБ локализуется преимущественно в нервной системе. Затем ими была разработана методика выработки «фиксированного» или лабораторного вируса бешенства с инкубацией в 7 дней, адаптированный к центральной нервной системе, т.к. при введении подкожно он не вызывал болезни. Методом для ослабления вирулентности был выбран высушивание. Путём высушивания спинного мозга больного кролика в течение 14-15 дней, вирус был ослаблен так, что уже не вызывала бешенство. Так как такая сушка давала максимальную степень безопасности, мозг начали применять в качестве вакцины. Прививки должны быть сделаны во время инкубационного периода и тогда она свидетельствовала об эффективности. Таким образом, Пастер и его сотрудники предложили научно-обоснованный способ предохранения от заболевания людей и животных.

Но позже выяснилось, что высушивание зараженного мозга приводит ВБ не просто к ослаблению, а к полной потере вирулентности. Таким 8

образом, по незнанию, вместо ослабленных живых микроорганизмов он создал нейтрализованный агент и открыл путь для разработки вакцин второго класса, известных как инактивированные вакцины.

В 1892 г. В.Бабеш, а в 1903 г. А.Негри обнаружили и описали специфические внутриклеточные включения в нейроцитах погибших от бешенства животных, чем существенным образом облегчили установления посмертного диагноза, но название Бабеша-Негри появилось только в 1950 г.

В 1903 г. сотрудник института Пастера в Париже П. Ремленже установил, что возбудителем бешенства является не бактерия, а фильтрующийся вирус.

Вскоре появилось множество модификаций вакцины Пастера. Филипс предложил содержать вируссодержащую мозговую взвесь в глицерине, а перед вакцинацией разводить в физиологическом растворе и феноле. Этим можно увеличить срок годности вакцины до 1 месяца (М. Селимов, 1978).

Затем были созданы антирабические вакцины, частично или полностью инактивированные путем физического и химического воздействия. Из вакцин, инактивированных физическим воздействием, а именно, действием ультрафиолетовых лучей, известна вакцина Уэбстера и Касальса. Такая вакцина до сих пор используется в практике.

В 1907 г. Ферми для инактивации вируса начал использовать фенол. Вакцина, приготовленная по Ферми, содержит некоторое количество живого вируса, что привело к развитию осложнений под названием «лабораторное бешенство». Ремленже предложил готовить антирабические вакцины путем ослабления фиксированного вируса эфиром. Вакцина Хемпта, частично инактивированный, также вызывала осложнения.

Модификацией вакцины Ферми стала вакцина Семпла, в которой вирус полностью инактивирован, но из-за содержания в них миелина нередко вызывали неврологические осложнения у пациентов и для снижения реактогенности был налажен выпуск инактивированных вакцин на основе вируса из мозга новорожденных животных (E. Fuenzalida, 1973), однако и эти вакцины оказались энцефалитогенными. Такой тип вакцины, выведенная из головного мозга овец, по-прежнему производится и используется в Эфиопии, несмотря на то, что эта вакцина не поощряется ВОЗ с 1990-х годов.

Еще одним общим недостатком всех применяемых тогда вакцин является их термолабильность и ограниченный срок годности.

Использование нейронной тканевой вакцины было очень распространено, но, к сожалению, вызывал поствакцинальный энцефалит. Этот тип вакцины оставался связанным с тяжелыми неврологическими реакциями из-за производства АТ против миелина или других веществ нервной ткани животных, присутствующих в продукте. Белок миелина в вакцине стимулирует иммунный ответ и в то же время действует на нервную систему реципиента. Наличие остаточного живого вируса в некоторых ранних препаратах из-за недостаточной инактивации привело к самому заболеванию. Таким образом, использование нейронной вакцины постепенно прекращалось, как это было рекомендовано Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ).

Заключение

В данной работе был разработан метод выявления ВНА к вирусу бешенства в 4 сериях сывороток. Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейтрализующих антител является индикатором эффективности вакцинации, так как только

вируснейтрализующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции (Dietschold В.,1990: Lafon М,1990). Но, к сожалению, разработанный метод нетехнологичен и не может применяться в промышленных целях. В продолжении работы разрабатывается ИФА тест- система для увеличения чувствительности к АТ для рутинных исследований.

В заключение хотелось бы сказать, что бешенство - это глобальная угроза для страны, мира в целом. Необходимо дальнейшее совершенствование методов средств и методов лабораторной диагностики вируса бешенства, контроля эффективности антирабических вакцин. Но контроль над этой эпидемической болезнью будет только возможен путем формирования политики на глобальном, региональном и на национальном уровне. Поэтому следует прилагать больше усилий для улучшения контроля над бешенством - зоонозным заболеванием с самым высоким уровнем смертности.

Список литературы

1. Алимов Д.В. Бешенство животных / Д.В. Алимов. Душанбе: Дониш, 1984. - 92 с.

2. Бароян О.В. Эпидемиологические аспекты современной эпидемиологии / Бароян О.В. Лепин П., 1972 // М., «Медицина», 255 с.

3. Блинкин С.А. 1976. У порога незримого. Электронный ресурс / Режим доступа: https://bio.wik**eading.ru/ 6168

4. Богомолов, Б. П. Дифференциальная диагностика инфекционных болезней / Б.П. Богомолов. — М., 2000. — 232 с.

5. Груздев К.Н. Бешенство животных / К.Н. Груздев, В.В. Недосеков // М.: Аквариум, 2001. - 304 с.

+ еще 43 источника

Примечания

Оригинал в pdf