«Использование бактерий bacillus subtilis 26д, дефицитных по гену сурфактин-синтетазы, для оценки роли сурфактина в защите пшеницы от септориоза злаков» - Дипломная работа

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Характеристика бактерий рода Bacillus и их значение для человека 9

1.2. Липопептиды 11

1.3. Характеристика возбудителя септориоза злаков 15

1.4. Механизмы защиты растений от патогенов 19

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 22

2.1. Объекты исследования 22

2.2. Условия культивирования эндофитных бактерий B. subtilis и его трансгенных штаммов 22

2.3. Методы стерилизации посуды и приборов для экспериментов 22

2.4. Выделение ДНК из клеток бактерий B. subtilis 26Д, subtilis 26Д sfp 23

2.5. Амплификация полноразмерного гена sfp из генома бактерий штаммов B. subtilis 26Д, B. subtilis 26Д sfp- 24

2.6. Аналитический гель-электрофорез ДНК 24

2.7. Постановка опыта на выявление устойчивости пшеницы к заболеванию септориоз 25

2.8. Проверка прямой антифунгальной активности 26

2.9. Измерение площади зоны поражения поверхности листьев 26

2.10. Транскрипционная активность генов 26

2.11. Статистическая обработка данных 27

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 28

3.1. Оценка транскрипции гена sfp бактерий B. subtilis 26Д и B. subtilis

26Д sfp- 28

3.2. Проверка антагонистических (фунгицидных) свойств бактерий B.

subtilis 26Д, B. subtilis 26Д sfp- 29

3.3. Влияние бактерий с подавленным синтезом сурфактина на иммунитет растений пшеницы 31

3.3.1. Визуальная оценка влияния бактерий B. subtilis 26Д, B. subtilis 26Д sfp- на площадь инфицирования листьев пшеницы грибом St. nodorum 31

3.3.2. Изучение транскрипционной активности некоторых генов защитных белков пшеницы 33

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ МАТЕРИАЛА ВЫПУСКНОЙ

КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ БИОЛОГИИ 36

4.1. Роль биологического образования 36

4.2. Цели и задачи биологического образования 38

4.3. Анализ тематического планирования раздела «Биология. Бактерии, грибы, растения», 6 класс 39

4.4. Использование ЛСМ в процессе изучения школьного курса биологии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 52

ВЫВОДЫ 53

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 54

ПРИЛОЖЕНИЯ 61

Введение

Заболевания пшеницы, вызванные микроскопическими грибами, являются весьма вредоносными и приводят к большим потерям урожая. Гриб Stagonospora nodorum - возбудитель септориоза злаков, известен своим глубоким поражающим действием. В борьбе с ним агротехнические мероприятия не всегда достаточно эффективны и не могут способствовать полному уничтожению гриба без ущерба урожаю и самому растению пшеницы.

В настоящее время наиболее распространенным методом борьбы с грибковыми заболеваниями культурных растений в сельскохозяйственной промышленности являются химические меры борьбы против возбудителя. Они очень эффективны, но имеют ряд недостатков, таких как постепенное приобретение устойчивости к препаратам у патогенных микроорганизмов, способность накапливаться в почве и высокая токсичность по отношению к высшим организмам.

Биологические меры защиты более перспективны и имеют преимущества над химическими в силу того, что они экологичны, биобезопасны и не формируют устойчивости у патогенов. Биологические препараты основаны на биоразлагаемых и нетоксичных веществах. К таким средствам защиты растений относят и биологически активные соединения, выделяемые микроорганизмами и сами микроорганизмы (Pieterse et al., 2007).

Эндофитные бактерии рода Bacillus знамениты своими способностями синтезировать широкий спектр биологически активных веществ. Среди них наибольший интерес последнее время привлекают липопептиды, состоящие из цепочки в 8-14 аминокислот с присоединенной жирной кислотой. Эти амфифильные мембранотропные вещества способны, согласно литературным данным, как напрямую воздействовать на микроорганизмы, так и влиять на иммунитет высших организмов (Недорезков и др., 2003). В лаборатории биохимии иммунитета растений Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН было показано, что при обработке растений пшеницы эндофитными бактериями рода Bacillus subtilis, увеличивается устойчивость к возбудителю септориоза пшеницы и активируются защитные гены растений.

Актуальность исследования.

Сурфактин является одним из самых широкоизучаемых липопептидов благодаря своему свойству сильно снижать поверхностное натяжение воды, а так же уникальным противомикробным и антифунгальным свойствам. Создание в исследовательских целях микроорганизмов с измененным геномом является современным подходом для изучения роли отдельных метаболитов. В связи с этим применение дефицитных по гену синтеза сурфактина бактерий штамма B. subtilis 26Д, созданных в лаборатории биохимии иммунитета растений УФИЦ РАН, для подробного изучения биологических свойств данного липопептида, является весьма актуальным.

Цель исследования:

Изучение роли бациллярного сурфактина в защите растений пшеницы от фитопатогенного гриба Stagonospora nodorum с использованием трансгенных бактерий B. subtilis 26Д, дефицитных по гену сурфактин - синтетазы для оценки роли сурфактина в индукции иммунной системы растений.

Задачи исследования:

1. Установить транскрипционную активность гена sfp бактерий B.subtilis 26Д и B. subtilis 26Д sfp-;

2. Изучить антифунгальные свойства бактерий B. subtilis 26Д и B. subtilis 26Д sfp- по отношению к грибу St. nodorum;

3. Оценить влияние предобработки семян пшеницы бактериями B. subtilis 26Д и B.subtilis 26Д sfp- на размер инфекционных пятен при заражении возбудителем септориоза;

4. Изучить влияние обработки трансгенными и исходным штаммами B. subtilis 26Д на компоненты защитной системы растений пшеницы в норме и при инфицировании возбудителем септориоза.

Научно-практическая значимость:

Совокупность полученных данных позволяет расширить современные представления о физиологических и биохимических механизмах формирования устойчивости растений к патогенам под влиянием эндофитных бактерий и понять роль в этом бациллярного сурфактина. Полученные результаты могут стать важным аспектом при разработке экологически безопасных антифунгальных препаратов.

Научная новизна:

В ходе работы с использованием дефицитных по гену сурфактин - синтетазы бактерий B. subtilis 26Д, была доказана роль сурфактина в защите растений как напрямую, благодаря его антифунгальным свойствам, так и опосредованно - через стимуляцию иммунитета растений.

Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений Института биохимии и генетики УФИЦ РАН. Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории биохимии иммунитета растений, особенно к.б.н., н.с. Бурхановой Гузель Фанилевне и к.б.н., н.с. Благовой Дарье Константиновне за помощь в исследованиях и интерпретации результатов, своему научному руководителю, к.б.н., н.с. Черепановой Екатерине Александровне за обучение, организацию исследований и всестороннюю помощь, а также профессору Максимову Игорю Владимировичу, к.б.н. Абрамову Сергею Николаевичу, профессору Горбуновой Валентине Юрьевне за предоставленную возможность работать в данном научном направлении.

Апробация. По материалам данной работы опубликованы 2 статьи:

1. Латыпова Г. Ю., Черепанова Е. А., Максимов И. В. «Бактерии рода Bacillus: роль в природе и области применения человеком». В V Пущинской школе-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» (3-7 декабря 2018г., Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, Пущино)

2. Латыпова Г. Ю., Черепанова Е. А., Максимов И. В. «Вредоносность септориоза пшеницы и меры борьбы с ним». В журнале Colloquium-jornal- 2019/10.

Выдержка из текста работы

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Характеристика бактерий рода Bacillus и их значение для человека

Бактерии рода Bacillus широко распространены в природе. Они знамениты своим большим ареалом обитания и способностью выживать в самых различных условиях - от пустынных местностей с жарким климатом, до холодных арктических зон. Бактерии рода Bacillus обитают как в почве, так и в водной среде (в пресных водах, морях и океанах). Представителями рода являются термофильные (B. thermophilus), психрофильные,

ацидофильные (B. acidocaldarius), алкалифные (B. alcalophilus),

галотолерантные и галофильные (B. halodurans) (Joan L Slonczweski et al.,2011) .

Общими чертами видов данного рода бактерий являются: - палочковидное строение клетки;

- образование спор;

- аэробное дыхание;

- гетеротрофный способ питания;

- отсутствие способности фотосинтезу.

Бактерия B. subtilis впервые была открыта Христиан Готфит Эрнбергом, биологом из Германии, в 1835 году. Данной бактерии было присвоено название - сенная палочка из-за того, что она хорошо культивировалась на сенном экстракте. B. subtilis является примечательной тем, что она способна производить почти 200 видов антибиотиков. Было выявлено, что все изученные штаммы B. subtilis производят своеобразный набор антибиотиков ограничивающиеся исключительно малым объемом веществ (Moszer et al., 2002). Гены, вовлеченные в биосинтез антибиотиков, занимают около 4-5% от всего генома бактерии B. subtilis. Они способны производить различные биологически активные молекулы, например, сидерофоры, биосурфактанты, цианистый водород, гидролазы.

Бактерии рода Bacillus обладают свойствами подавлять рост и развитие других патогенных бактерий (стафилококков, сальмонелл, стрептококков, протей). Так же вырабатывают ферменты, затрудняющие процесс гниения тканей. Синтез ферментов, антибиотиков и витаминов являются немаловажными свойствами данных бактерий. Благодаря таким свойствам бактерии Bacillus применяются в разных отраслях хозяйственной деятельности человека.

На сегодняшний день разработаны множество препаратов, основанных на использовании бактерий данного рода. Эти препараты широко применяют для оздоровления от различных заболеваний животных, птиц, рыб, людей. Антагонистические свойства бацилл дают возможность подавлять развитие патогенных бактерий и грибов, биологически активные вещества - стимулировать иммунитет.

Убивающие микробы вещества, которые производит B. subtilis, имеют селективный характер, убивают и ингибируют развитие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. При этом не вызывают гибели полезной микрофлоры. Например, не взаимодействуют с лактобактериями, бифидобактериями. Для лечения кишечных инфекций людей, дисбактериоза детей используют препараты на основе бактерий Bacillus, например, Ветом, Супрадин киндер гель, Бактистатин. Эти препараты основаны на избирательности действующих веществ бацилл.

B. subtilis обладает свойством эндофитности, то есть способна существовать внутри тканей растений, не причиняя им вреда. Более того, благодаря продукции ими биологически активных соединений, эти бактерии способны стимулировать рост растений и считаются перспективными агентами биологического контроля (Максимов,2015)

Например, препарат Бактофит имеет антифунгальную активность благодаря присутствию B. subtilis ИПМ 215 и уменьшает развитие такого заболевания, как септориоз пшеницы с биологической эффективностью до 60%. Также данный препарат проявляет эффективность в борьбе с бурой ржавчиной пшеницы до 65% и подавляет гельминтоспориоз ячменя с эффективностью 17-23%. Помимо антифунгальных свойств он стимулирует урожайность зерновых культур (Недорезков и др., 2003).

Фитоспорин является наглядным примером препаратов на основе B. subtilis 26Д. Данный препарат является рентабельным против заплесневения и гниения семян разнообразных культур (Список пестицидов, 2008).

Таким образом, B. subtilis - уникальные бактерии, которые, благодаря своей неприхотливости и продукции широкого спектра биологически активных веществ широко используются человеком в таких сферах, как медицина, ветеринария, сельскохозяйственные и промышленные производства.

Заключение

1. Было выявлено, что трансгенный штамм B. subtilis 26Д sfp- дефицитный по гену сурфактин-синтетазы , менее эффективно ингибирует рост и развитие St. nodorum по сравнению с B. subtilis 26Д.

2. Проведенный ПЦР-анализ подтвердил отсутствие в штамме B. subtilis 26Д sfp- гена sfp, отвечающего за экспрессию сурфактин-синтетазы.

3. Определена важная роль бациллярного сурфактина в защите пшеницы от септориоза, выражающаяся в снижении площади инфекционных пятен у предобработанных B. subtilis 26Д растений по сравнению с обработанным трансгенным штаммом.

4. Выявлено, что B. subtilis 26Д sfp- с нарушенным синтезом сурфактина не приводит к активации транскрипции защитных генов пшеницы, в отличие от B. subtilis 26Д, что свидетельствует о вовлечении бациллярного сурфактина в работу генов защитных белков растений.

Список литературы

1. Вакин А.Т., Головин П.Н. и др. Словарь-справочник фитопатолога.Ленинград Издательство.: Сельхозгиз, 1959. - 414 с.

2. Волков С.М., Зимин Л.С., Руденко Д.К., Тупеневич С.М. Альбом вредителей и болезней сельскохозяйственных культур нечерноземной полосы европейской части СССР. - Москва-Ленинград:

государственное издательство сельскохозяйственной литературы, 1955. - 488 с.

3. Воронина Г.А. О развитии школьного биологического образования за рубежом // Биология в школе. - 2011. - № 8. С. 35-39

4. Максимов И. В., Веселова С. В., Нужная Т. В, Сарварова Е. Р., Хайруллин Р. М. Стимулирующие рост растений бактерии в регуляции устойчивости растений к стрессовым факторам. Т.62, № 6, г.2015, С.763-775

5. Мелентьев А.И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Cohn в агроэкосистемах. М.: Наука. 2007. 147 с.

+ еще 54 источника

Примечания

Оригинал в pdf