«Идентификация новых изолятов бактерий семейства термоактиномицетов - продуцентов гидролитических ферментов и биологически активных веществ» - Дипломная работа

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6

1.1. Бактерии группы Thermoactinomycetaceae, их экологические особенности, распространенность и идентификация 6

1.2. Биотехнологический потенциал термоактиномицетов и хитиназы термофильных микроорганизмов 16

Заключение 23

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 24

2.1. Выделение и скрининг продуцентов хитиназ 24

2.2. Фенотипическая характеристика и идентификация хитинолитических изолятов термоактиномицетов 24

2.3. Генетическая характеристика изолятов 25

2.4. Условия поддержания и культивирования хитинолитических изолятов 26

2.5. Определение хитиназной активности 26

2.6. Определение концентрации белка 27

2.7. Оценка глубинного роста хитинолитических изолятов 27

2.8. Приготовление коллоидного хитина 28

2.9. Световая микроскопия 28

2.10. Статистическая обработка данных 28

2.11. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 29

3.1. Общая характеристика новых хитинолитических изолятов актинобактерий и их источники 29

3.2. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности новых изолятов 33

3.3. Идентификация изолятов на основе анализа гена 16S рРНК 36

3.4. Синтез хитинолитических ферментов в глубинной культуре умеренно термофильных изолятов Laceyella saccharii продуцируемых термофильными штаммами Laceyella saccharii 39

Глава 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВНЕДРЕНИЮ МАТЕРИАЛОВ ДИПЛОМНОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНЫХ КУРСАХ «БИОЛОГИЯ» 41

4.1. Роль биологического образования в школе 41

4.2. Анализ тематического планирования по разделам учебников биологии 42

4.3. Разработка урока биологии в школе 46

4.4. Использование логико-смысловой модели в процессе образования. 54

ВЫВОДЫ 56

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 60

ПРИЛОЖЕНИЕ 70

Введение

Актуальность исследования. Термоактиномицеты (семейство Thermoactinomycetaceae) являются малоизученной группой

грамположительных хемоорганотрофных бактерий, проявляющих способность к формированию эндоспор, свойственную для порядка бацилл (Bacillales) с одновременным образованием воздушного и субстратного мицелия, как у настоящих актинобактерий.

Особый интерес представляют термофильные представители этой группы, продуцирующие термостабильные ферменты - протеазы (сериновые протеазы, термитазы и др.), амилазы и липазы, имеющие температурный оптимум при 65-75°С и более. Оптимум биосинтеза гидролитических ферментов различными видами этих бактерий обычно составляет 50-55°С.

Представители термоактиномицетов наиболее часто обнаруживаются в прелых кормах и других растительных материалах, таких как солома зерновых злаков, хлопок, компосты, сено, навоз. Однако, до настоящего времени не были описаны хитин-деградирующие штаммы этих бактерий.

Цель настоящей работы - охарактеризовать и идентифицировать новые хитинолитические изоляты термоактиномицетов, впервые обнаруженные в грунтах пещер Кавказа.

Задачи работы:

1. Изучить культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки новых штаммов согласно основным критериям, разработанным для семейства термоактиномицетов;

2. Установить филогенетическое положение выделенных штаммов в группе Thermoactinomycetaceae на основе анализа гена 16S рРНК.

3. Изучить особенности синтеза внеклеточных хитинолитических ферментов новыми изолятами термоактиномицетов;

4. Изучить некоторые физико-химические свойства хитиназного комплекса наиболее активного штамма.

Ожидаемые результаты и научная новизна работы.

Будут выявлены физиолого-биохимические и экологические особенности новых термофильных штаммов термоактиномицетов, выделенных из грунта пещер, изучена их роль в биодеградации хитина и уточнено филогенетическое положение, и близость к известным видам семейства Thermoactinomycetaceae. Впервые будут описаны новые хитинолитические штаммы термоактиномицетов, выделенные из нетипичных местообитаний - грунтов пещер. Впервые будет охарактеризован ферментный комплекс хитинолитических ферментов, синтезируемых пещерными изолятами термоактиномицетов.

Практическая значимость. Выделенные штаммы могут быть использованы в качестве потенциальных продуцентов термофильных хитиназ для разработки новых высокоактивных препаратов хитинолитических ферментов, перспективных для применения в различных областях промышленной биотехнологии и агробиотехнологий, в том числе для разработки новых средств защиты растений и ферментативной конверсии хитин-содержащего сырья животного и грибного происхождения.

Выдержка из текста работы

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бактерии группы Thermoactinomycetaceae, их экологические особенности, распространенность и идентификация

Термоактиномицеты представляют собой аэробные,

грамположительные, хемоорганотрофные бактерии, образующие хорошо развитый субстратный мицелий с разветвленными и септированными гифами. Для представителей этой группы характерно формирование обильного воздушного мицелия белого или желтого цвета. Термоактиномицеты формируют одиночные споры на субстратном и воздушном мицелии, сидячие на простых или разветвленных спорофорах со всеми признаками и строением, характерным для бактериальных эндоспор. Среди представителей группы встречаются термофильные и мезофильные виды. Различные виды термоактиномицетов были выделены из воздуха, увлажнителей и кондиционеров, почв, ила, морских донных отложений, заплесневелых и гниющих растительных материалов, компостов, зачастую подверженных самопроизвольному разогреванию.

Термоактиномицеты наиболее часто и обильно встречаются в заплесневелых животных кормах и других растительных материалах, таких как солома зерновых злаков, хлопок, компосты, сено и навоз. Их развитию в перечисленных субстратах благоприятствует самопроизвольный разогрев среды, например, навоза, до температур около 70 ° С, что зачастую приводит к их обильному росту с формированием до 107 спор/г сухого веса. Споры легко переносятся по воздуху при разрушении субстрата, однако при ограниченной аэрации рост может быть затруднен. Рост бактерий на агаре снижается вдвое при уменьшении концентрации кислорода в воздухе до 1% (о/о). Хотя в присутствии 0,1% кислорода незначительный рост имеет место, однако споруляция либо полностью прекращается, либо снижается до значений менее 1% [28].

Наиболее распространенным видом термоактиномицетов обычно является Thermoactinomyces vulgaris, однако обычными видами являются

также T. thalpophilus и T. dichotomicus, выделенный из грибного компоста [103]. T. saccharii наиболее обильно встречается в разогретом жоме сахарного тростника (багассе), где он занимает нишу, сходную с таковой у T. thalpophilus и T. vulgaris в заплесневелом сене. Все три перечисленных вида выделены также из почвы и торфа, хотя обычно в небольших количествах, редко превышая 104 КОЕ/г сухого веса почвы [42, 67]. Многие представители термоактиномицетов происходят из навоза, сточных вод или унавоженной почвы [22, 32], хотя возможно также отложение на фермах переносимых по воздуху спор из заплесневелого сена. Некоторый рост термоактиномицетов может происходить на растительности, нагретой под солнечным освещением. Даже в умеренных регионах, солнечное излучение может поднять температуру почвы и мусора до более чем 30°C [34]. Эрозия почвы может приводить к накоплению спор термоактиномицетов в озерных илах и морских отложениях до 104-106 спор/г сухого веса [24]. Присутствие термоактиномицетов в морских экосистемах является надежным и установленным показателем размывания земных пород, поскольку прорастание и развитие спор не имеет места при низких температурах in situ [14, 43, 88]. Обнаружение видов Thermoactinomyces в глубоких буровых кернах и археологических раскопках предполагает, что их споры могут оставаться жизнеспособными в течение тысяч лет и, следовательно, могут быть полезными в качестве палеоиндикаторов в исследованиях сельскохозяйственной истории почв [23, 50, 83, 93, 106]. Виды T.

peptonophilus и T. putidus также были выделены из почвы [84], тогда как вид T. middleus был обнаружен только в кондиционерах, увлажнителях, домашней пыли, и травяном компосте [66], где он встречается с другими видами термоактиномицетов [65].

Классификация термоактиномицетов претерпела значительные изменения со времени первого издания Руководства Берджи по систематике бактерий, в котором они были отнесены к роду Thermoactinomyces [69], таксону, охватывающему преимущественно термофильные организмы. Род Thermoactinomyces и его типовой вид, T. vulgaris, были впервые описаны П.В. Циклинской в 1899 г. Впоследствии были предложены дополнительные виды термоактиномицетов, в том числе T. peptonophilus Nonomura и Ohara 1971, T. sacchari Lacey (1971a), T. candidus Kurup et al. 1975, T. middleus Kurup et al. 1980, T. thalpophilus Unsworth and Cross (1980) и T. putidus Lacey and Cross 1989.

В последние годы T. candidus и T. thalpophilus были реклассифицированы как T. vulgaris и T. sacchari, соответственно, на основе данных ДНК-гибридизации и анализа гена 16S рРНК [116]. Дополнительные сравнительные исследования на представителях достоверно установленных видов Thermoactinomyces показали, что они принадлежат к четырем филетическим линиям, таксономическое положение которых было подтверждено хемотаксономическими и фенотипическими данными [114]. На основе этих данных были предложены три новых рода. T. putidus и T. sacchari были отнесены к роду Laceyella как Laceyella putida и Laceyella sacchari, T. peptonophilus - к роду Seinonella как Seinonella peptonophila, и T. dichotomicus - к роду Thermoflavimicrobium как Thermoflavimicrobium dichotomicum. Пересмотренный род Thermoactinomyces остался исходным таксоном, вмещающим виды T. middleus и T. vulgaris.

Семейство Thermoactinomycetaceae было предложено Matsuo с соавт. (2006) для локализации родов Laceyella, Mechercharimyces, Planifilum, Seinonella, Thermoactinomyces и Thermoflavimicrobium [77]. Данный таксон является одним из семейств, составляющих порядок Bacillales. Отношения между родами, составляющими данное семейство, а также между ними и типовыми штаммами типовых видов некоторых родов, классифицированных в порядке Bacillales, представлены на рис. 1.1.

Субстратный мицелий термоактиномицетов состоит из прочных разветвленных, септированных гиф, из которых развиваются воздушные гифы. Сначала они возникают вертикально, но у большинства видов образуют рыхлую сеть почти прямых гиф над субстратом [76]. 

Заключение

1. Из образцов грунта Новоафонской пещеры и донных отложений серных источников пещеры Шеки-Хьех выделено 17 изолятов умеренно термофильных бактерий, развивающихся в диапазоне температур 45-60°С и способных расщеплять хитин.

2. Отобрано пять наиболее активных изолятов бактерий, образующих воздушный мицелий; на основе культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков отобранные штаммы отнесены к семейству Thermoactinomycetaceae.

3. С помощью анализа гена 16S рРНК все отобранные изоляты были идентифицированы как один вид Laceylla sacchari со степенью сходства 99,19-100%.

4. Максимальная продукция хитинолитических ферментов штаммами Laceylla sacchari наблюдается в присутствии коллоидного хитина в качестве источника углерода и достигает 0,2-0,5 ед/мл при стандартных условиях анализа.

5. У большинства изолятов максимум синтеза хитиназ достигает к 1-м суткам периодического культивирования, у штамма L. sacchari 1В-А4 стабильная продукция наблюдается в течение всего цикла культивирования, возрастая к 4-м суткам инкубации.

6. рН-профиль активности хитиназ L. sacchari 1В-А4 характеризуется наличием двух пиков при рН 5,5 и рН 7, что свидетельствует о возможной продукции этим штаммом нескольких ферментов, различающихся по рН- оптимумам гидролиза хитина.

7. Комплексы хитинолитических ферментов всех исследованных штаммов L. sacchari демонстрируют одинаковый температурный оптимум активности (65°С) при интервале наибольшей активности (60-70°С), свойственным для действия термофильных и термостабильных ферментов

Список литературы

1. Агре Н.С. Биология термофильных актиномицетов: автореф. дис. д- ра биол. наук: 03.00.07: защищена 14.11.1973: утв. / Агре Нина Семеновна. - Москва, 1973. - 50 с. - Библиогр.: с. 8

2. Герхардт Ф. Методы общей бактериологии: в 3 т. Ф. Герхардт. - М.: Мир, 1984. Т. 3.- 264 с.

3. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. - М.: Мир, 1991. - 544 с.

4. Калакуцкий Л. В. Биология развития актиномицетов / автореф. дис. . д-ра биол. наук : 09.60.00 : защищена 2.08.1970 : утв. / Калакуцкий Лев Владимирович. - Москва. - 696 с.

5. Нетрусов А. И. Практикум по микробиологии / А. И. Нетрусов. - М.: Издательский центр "Академия". - 2005. - 608 с.

+ еще 113 источников

Примечания

Оригинал в pdf