«Разработка метода микроклонального размножения растений Dendrobiumnobile 'White'» - Дипломная работа

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 3

ГЛАВА 1. ГИБРИД DENDROBIUM NOBILE ‘WHITE’ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 4

1.1. Биологические особенности семейства Orchidaceae

1.2.1. Общая характеристика рода 13

1.2.2. Описание гибрида Dendrobium nobile 'White 13

1.2.3. Систематическое положение Dendrobium nobile 15

1.3. Техника введения в культуру in vitro 17

1.3.1. Микроклональное размножение 17

1.3.2. Стерилизация эксплантов 18

1.3.3. Питательные среды 19

1.3.4. Влияние физических факторов 21

Заключение 22

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 24

2.1. Объект исследования 24

2.2.1. Этапы микроклонального размножения 24

2.2.2. Стерилизация лабораторного оборудования 25

2.2.3. Стерилизация эксплантов и питательных сред 26

2.3. Приготовление питательных сред для культивирования 27

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 30

3.1 Этапы размножения Dendrobium nobile 'White' в культуре in vitro 30

3.2 Влияние состава питательной среды на мультипликацию Dendrobium nobile 'White' 33

3.3 Влияние цитокининов на пролиферацию эксплантов Дедробиума 37

3.4 Влияние ауксинов на корнеобразование 38

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВНЕДРЕНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ БИОЛОГИИ 40

4.1. Место биологии в школьном образовании 40

4.2. Применение материала выпускной квалификационной работы в школьном курсе «Биология» 46

4.3. Разработка урока по биологии на тему «Вегетативное размножение растений» для 6 класса 54

4.4. Применение логико-смысловой модели в образовательном процессе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 60

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 63

ВЫВОДЫ 64

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 65

ПРИЛОЖЕНИЕ 66

Введение

Сохранение орхидей становится предметом глобального беспокойства, поскольку их естественная популяция истощается с угрожающей скоростью.

Орхидеи выращиваются в промышленных масштабах по всему миру в виде срезанных цветов и горшечных растений с долей 8% в торговле цветоводством. Он считается выдающимся в орнаментах из-за его разнообразных цветов, форм, форм и продолжительного цветения (Toukuhara and Mii, 2001). Среди орхидей Дендробиум занимает лидирующее положение среди различных сортов (Vendrame, 2008). Он размножается семенами, делением сгустков или корневищ, черенками, отделением побегов, полученных от стебля или псевдобульб. Основными препятствиями в его обычном распространении являются медленное размножение клонов и обеспечение недостаточного количества клонов в течение короткого периода времени (Martin and Madassary, 2006). Следовательно, размножение in vitro используется в качестве альтернативы для быстрого массового размножения ценных сортов, поскольку оно хорошо развивалось в течение последних десятилетий и предпочтительно использовалось в последние годы в развитых странах. Распространение Dendrobium nobile in vitro успешно осуществляется с использованием подходящей растительной среды и регуляторов роста (Aktar et al., 2008).

Специализированная морфология, структура и физиологические свойства орхидных всегда очаровывали ботаников, садоводов и биологов- эволюционистов, а красота и таинственность, окружающая эти декоративные драгоценности, всегда привлекали внимание как любителей, так и ученых. Орхидные образуют чрезвычайно своеобразную группу растений из-за их узкоспециализированной системы опыления, маленьких, тонких и неэндоспермных семян, обязательных требований микоризной ассоциации во время прорастания, разнообразных и космополитических местообитаний, передовых эвотенденции развития, экстраординарные механизмы адаптации и устойчивости в неблагоприятных условиях окружающей среды (Yagame et al., 2012). Тем не менее, быстрый и динамичный прогресс в молекулярной биологии и биотехнологии помогли создать новые сорта с такими характеристиками, как разноцветные цветы, устойчивость к болезням и вредителям, и позволили определить происхождение и Dendrobium за растущего спроса и популярности орхидных в настоящее время это многомиллионный бизнес, главным образом, в виде горшечных растений и срезанных стеблей (Winkelmann et al., 2006). Для удовлетворения спроса на орхидные в будущем, а также для сохранения их биоразнообразия, разработка и внедрение новых технологий очень важны для улучшения качества мощности, устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам и быстрого массового размножения представителей этого типа. В последнее время орхидные стали центром внимания новых областей исследований растений, включая генную инженерию, функциональную геномику, протеомику и метаболомику (Chang et al., 2011), все из которых требуют передовых трансгенных стратегий (Тейшейра да Силва и др., 2011) для достижения своих различных целей.

У любителей цветов чаще всего можно встретить большое разнообразие представителей рода Дендробиум Нобиль, в связи с его несложным уходом в домашних условиях, поэтому актуально установить связь между составом питательных сред, биотехнологией размножения орхидных и быстрым получением растений-регенерантов, что позволит в короткие сроки получить массовый посадочный материал.

Целью работы являлось определение перспективности стеблевых узлов для массового размножения дендробиума.

В задачи исследования входило:

1. определение оптимальных условий для введения стеблевых узлов Дендробиума 

максимального коэффициента мультипликации.

Научная новизна работы.

Проведено изучение микроклонального размножения Dendrobium nobile 'White'c учетом их биологических особенностей. Дано обоснование и показана целесообразность двухэтапного введения в культуру при использовании питательной среды для моноподиальных орхидей, а затем среды на основе комплексного минерального раствора Fertika Люкс, что позволяет добиться высокого коэффициента размножения и мультипликации. Методы культивирования тканей, разработанные в ходе эксперимента, являются эффективным решением для массового размножения D. nobile за короткий промежуток времени.

Создание надежной методологии клонирования для этой орхидеи важно с точки зрения обеспечения быстрого размножения и производства большого количества высококачественных растений. Таким образом, настоящее исследование было разработано для установления протокола пролиферации побегов in vitro и укоренения орхидеи Dendrobium nobile 'White'. Подбор питательной среды для обширного микроклонального размножения дорогостоящих сортов дендробиума послужит основой для распространения в промышленных масштабах.

Практическое значение.

Полученные результаты генетического исследования позволяют рекомендовать технологию микроклонального размножения Dendrobium nobile 'White' по пути формирования адвентивных почек через стеблевые узлы, как эффективную методику для масштабного производства данного сорта растения.

Апробация.

Работа выполнялась в лаборатории биотехнологии и генетики растений на базе Южно-Уральского ботанического сада-института УФИЦ РАН.

Продуктами выпускной квалификационной работы являются статьи, опубликованные в сборнике «Вавиловские чтения-2018» посвященный 131- летию со дня рождения академика Н.И.Вавилова: «Начальные этапы размножения Dendrobium nobile 'White' в культуре in vitro», «Молекулярно-генетические исследования генетической стабильности растений- регенерантов».

Выдержка из текста работы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнялась в лаборатории генетики и биотехнологии растений Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук.

2.1. Объект исследования

В качестве объекта исследования (Рис.) использовали растение Дендробиум Нобиле 'Вайт' (Dendrobium nobile 'White'), индуцированной в Уфимском Ботаническом саду. Как экспланты использовали стеблевые узлы, взятые с молодых зеленых побегов.

Рис. 6. Дендробиум Нобиле 'Вайт'

2.1.1. Этапы микроклонального размножения

При разработке метода микроклонального размножения растений нами были проведены следующие этапы:

1) Выбор растения-донора;

2) Стерилизация согласно общепринятым методикам (Бутенко, 1964; Калинин и др. 1980; Катаева и др., 1983);

3) Собственно микроклональное размножение;

4) Наблюдение и анализ полученных вследствие размножения растений- регенерантов;

5) Исследование влияния минеральных и органических подкормок на интенсивность роста и развития молодых растений.

2.1.2. Стерилизация лабораторного оборудования

Вся посуда, предназначенная для приготовления, хранения питательных сред и выращивания растительного материала, подвергается тщательной мойке.

1. Обработка мыльным раствором в течении 15 минут;

2. Промывка сильной струей тепло воды на протяжении 5 минут;

3. Двукратное ополаскивание дистиллированной водой;

4. После мытья посуду высушивают в сушильном шкафу при 100- 130оС;

5. Закрывают ватными пробками или целлофановыми колпачками;

6. Дальнейшее хранение в контейнерах или шкафах, защищенных от попадания пыли.

Стерилизация ламинар-бокса. Ламинар-боксы предназначены для культуры изолированных клеток, тканей и некоторых других работ, требующих стерильности. Стерильность обеспечивается с помощью бактериальных фильтров, установленных в ламинар - боксе, через которые нагнетается воздух. За 2 часа до начала работы ламинар - бокс облучают бактерицидными ультрафиолетовыми лампами. Предварительно в ламинаре размещают спиртовую горелку, спички, емкости с 96%-ным спиртом и стерильной водой, а также прочее необходимое оборудование. Внутреннюю поверхность ламинара и внешние поверхности всего вносимого в ламинар оборудования протирают 70%-ным спиртом. Перед работой в ламинар - боксе необходимо вымыть руки с мылом и протереть их спиртом

Фламбирование (прокаливание) - стерилизация над пламенем спиртовки или горелки. Этим методом обычно стерилизуют металлические предеты: пинцеты, бактериологические петли, ножницы, скальпель и др. (Маннапова, 2018).

Непосредственно перед работой и в её процессе инструменты (пинцеты, скальпели, иглы) еще раз стерилизуют в ламинар-боксе, помещая их в фарфоровый стакан с 96%-ным этиловым спиртом и обжигая в пламени горелки. Стерильный инструмент используют только для одной манипуляции. Очень тонкие инструменты (иглы, лезвия и т.п.) могут терять свои свойства при обжигании, поэтому их стерилизуют, погружая в спирт (Калинин, 1992).

Предварительная стерилизация инструментов (скальпелей, пинцетов, игл и т.д.) заключается в нагревании сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 2 часов при температуре 140оС (Черевченко, 2008).

Стерилизация сухим жаром в печах Пастера. Печь Пастера - двухстенчатый сушильный шкаф. В печах Пастера стерилизуют стеклянную посуду, пробирки, чашки Петри, шприцы, металлические инструменты, обернутые для последующего сохранения стерильности до применения в работе. Нельзя стерилизовать сухим жаром воспламеняющиеся вещества, питательные среды, воду, резиновые предметы (Маннапова, 2018).

Заключение

Данная работа посвящена разработке метода микроклонального размножение, а именно подбору оптимальной среды для Dendrobium nobile 'White'.

В ходе работы мы изучали влияние различных составов питательных сред, используемых для микроклонального размножения, на скорость пролиферации побегов с целью разработки методов микроклонального размножения Dendrobium nobile 'White' для возможности введения в массовое производство. В результате были получены растения-регенеранты с максимальной жизнеспособностью 95%, коэффициент мультипликации которых был равен 13,45 ± 6,55 шт.

Таким образом, использование комплексного минерального раствора Fertika Люкс позволяет добиться высокого коэффициента размножения и мультипликации. Методы культивирования тканей, разработанные в ходе эксперимента, являются эффективным решением для массового размножения D. nobile за короткий промежуток времени.

Список литературы

Асмолов А. Г. Система заданий: пособие для учителя [Текст] / А.Г. Асмолов, Г.В. Бурменская, И.А. Володарская и др.; под ред. А.Г. Асмолова. - 2-е изд. - М.: Просвещение, 2011. -с. 45

Белицкий И.В. Орхидеи. [Текст] / И.В. Белицкий; ООО «Издательство Астрель», 2001. - с. 6-7

Бутенко, Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе [Текст] / Р. Г. Бутенко; МГУ им. М. В. Ломоносова. - М. : ФБК-ПРЕСС, 1999. - 158, [1] с. : ил.; 24 см.; ISBN 5-89240- 059-X

Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. [Текст] / М.: Наука, 1964. - с. 272.

Гончаров М. Ю. Систематика цвеетковых растений учебное пособие М. Ю. Гончаров М.Н.

+ еще 25 источников

Примечания

Оригинал в pdf