«Оценка экспрессии hif-зависимых генов для поиска соединений, обладающих противогипоксическим действием» - Дипломная работа

Содержание

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1. Роль транскрипционного фактора HIF1 в адаптации клеток к гипоксическим условиям 7

1.2. Структура гена HIF1 8

1.3. Препараты, обладающие ноотропным действием ГВС-111 (Ноопепт) и ЦПГ 11

1.3.1. ГВС-111 12

1.3.2. ЦПГ 13

1.4. Гены, регулируемые транскрипционным фактором HIF и их биологическое значение 5

1.4.1. Фактор роста эндотелия сосудов А 18

1.4.2. Матриксная металлопротеиназа 2 21

1.4.3. Киназа пируватдегидрогеназы 1 24

1.4.4.BCL-2 взаимодействующий белок 3 26

1.4.5.Белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста 28

ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 31

2.1. Материалы исследования 31

2.2. Методы исследования 32

2.2.1. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 32

2.2.2. Клеточные линии и культивирование клеток 33

2.2.3. Моделирование условий гипоксии для клеток 33

2.2.4. Выделение РНК 34

2.2.5. Синтез кДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы 35

2.2.6. Аналитический гель-электрофорез РНК 36

2.2.7. Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (Real-Time PCR) 37

2.2.8. Анализ результатов 38

ГЛАВА З.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 40

3.1.Оценка количества мРНК гена HIF1 а под действием Ноопепта и ЦПГ 40

3.2.Исследование влияния Ноопепта на экспрессию HIF-зависимых генов 41

З.З.Оценка влияния ЦПГ на экспрессию HIF-зависимых генов 45

3.4.Обсуждение результатов 49

ГЛАВА 4.Методические рекомендации по использованию результатов выпускной квалификационной работы в программе высшего учебного заведения 50

4.1. Роль биологического образования в университете 50

4.2. Содержание занятия «Определение количества гемоглобина в крови» в курсе дисциплины «Физиология человека и животных» 51

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 59

ВЫВОДЫ 61

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 62

ПРИЛОЖЕНИЯ 70

Введение

Актуальность работы. Поддержание кислородного гомеостаза в клетках имеет основополагающее значение для выживания организма. Большим достижением в биологии и физиологии последнего десятилетия явилась расшифровка молекулярного механизма поддержания гомеостаза кислорода. Основой этого механизма являются факторы, индуцированные гипоксией: HIF1 и HIF2. Транскрипционный фактор HIF1 был первым клонированным фактором и является наиболее изученной изоформой. HIF1 играет главную роль в системном ответе на гипоксию, в результате которой высвобождается кислород. Являясь ключевыми медиаторами клеточного гомеостаза кислорода, HIF1 контролирует передачу кислорода тканям и адаптацию к кислородному истощению путем регуляции экспрессии генных продуктов, включающихся в клеточный энергетический метаболизм, вазомоторную регуляцию, транспорт глюкозы, эритропоэз, ангиогенез, апоптоз, клеточную пролиферацию и другие процессы, влияя как на межклеточное взаимодействие, так и взаимодействие клетка — субстрат. Идентификация таких генов-мишеней HIF1 является центральной в понимании механизмов модуляции клеточных путей во время гипоксии. Кроме того, оценка экспрессии HIF-зависимых генов может вносить вклад в изучение соединений, обладающих противогипоксическим действием.

Научная новизна. Впервые изучено влияния двух оригинальных ноотропных соединений (Ноопепт и циклопролинглицин) на экспрессию генов (VEGFA, PDK1, MMP2, IGFBP3, BNIP3), регулируемых

транскрипционным фактором HIF1, в условиях нормоксии и модели гипоксии в культуре клеток SH-SY-5Y. Впервые показано, что Ноопепт и циклопролинглицин оказывают влияние на экспрессию генов участвующих в адаптации клеток к гипоксии.

Цель работы.

Изучить HIF-зависимые гены, активирующиеся под воздействием противогипоксических препаратов пептидной природы Ноопепта и циклопролинглицина в культуре клеток нейробластомы в норме и модели гипоксии.

Для достижения цели данной работы были поставлены следующие задачи:

1. Оценить количество мРНК гена HIF1a, в норме под действием Ноопепта и циклопролинглицина в культуре клеток SH-SY-5Y;

2. Исследовать количество мРНК гена HIF1a, в модели гипоксии под действием Ноопепта и циклопролинглицина в культуре клеток SH-SY- 5Y;

3. Оценить количество мРНК генов VEGFA, PDK1, BNIP3, IGFBP3, MMP2 в норме под действием Ноопепта и циклопролинглицина в культуре клеток SH-SY-5Y;

4. Исследовать количество мРНК генов VEGFA, PDK1, BNIP3, IGFBP3, MMP2, в модели гипоксии под действием Ноопепта и циклопролинглицина в культуре клеток SH-SY-5Y;

5. Разработка методических рекомендаций по использованию результатов исследования в курсе биологии.

Апробация: по содержанию дипломной работы была опубликована статья в журнале «Интеграция наук» (декабрь 2018 г.) и статья в журнале «Форум молодых ученых» (апрель 2019 г.).

Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии Уфимского научного центра Российской академии наук.

Выдержка из текста работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль транскрипционного фактора HIF1 в адаптации клеток к гипоксическим условиям

Клетки млекопитающих должны поддерживать надлежащий уровень кислорода, чтобы выполнять аэробный метаболизм и выработку энергии. Градиенты кислорода играют важную роль в физиологии млекопитающих; низкий уровень кислорода или гипоксия обеспечивает необходимый внеклеточный стимул для правильного эмбриогенеза и заживления ран, а также поддерживает плюрипотентность стволовых клеток. Гипоксия, которая связана с давлением кислорода ниже нормального физиологического диапазона, может ограничить функции органов, тканей или клеток (Колясникова, 2018). Патологическая гипоксия может быть вызвана уменьшением подачи кислорода, например, вызванным большой высотой или локализованной ишемией из-за нарушения кровотока в данной области. Кроме того, при раке, заболеваниях сердца или хронических обструктивных заболеваниях легких, клеточный кислородный баланс сильно нарушается, и клетки становятся гипоксичными. Гипоксия распространена во многих типах твердых опухолей, где опухолевые клетки быстро размножаются и образуют большие твердые опухолевые массы, приводящие к обструкции и сдавливанию кровеносных сосудов, окружающих эти массы. Эти аномальные кровеносные сосуды часто не функционируют должным образом и приводят к плохой подаче кислорода в центральную область опухоли. Опухолевые клетки в этой области начинают адаптироваться к условиям низкого содержания кислорода, активируя несколько путей выживания. Активация транскрипционного фактора HIF1 является наиболее частым путем адаптации гипоксических клеток к жесткой микросреде (Xiaowei et al., 2006).

Активированный HIF1 играет важную роль в адаптивных реакциях клеток на изменение кислорода. Происходит активация транскрипции более

100 генов, которые регулируют жизненно важные биологические процессы, необходимые для выживания и прогрессирования опухоли. Например, гены, участвующие в метаболизме глюкозы, пролиферации клеток, миграции и ангиогенезе. HIF1 является важным регулятором метаболизма, который позволяет быстро адаптироваться к доступности кислорода. Этот эффект опосредуется через ключевые регуляторы биоэнергетики и роста. В быстро растущей опухолевой ткани HIF1 помогает гипоксическим опухолевым клеткам изменить метаболизм глюкозы от более эффективного окислительного фосфорилирования к менее эффективному

гликолитическому пути для поддержания производства энергии (эффект Варбурге). По этой причине гипоксические клетки имеют тенденцию потреблять больше глюкозы для удовлетворения своих энергетических потребностей (Кирова, 2016). HIF1 опосредует это метаболическое превращение посредством индукции ферментов, участвующих в гликолизе и сверхэкспрессии переносчиков глюкозы (GLUT), которые увеличивают поступление глюкозы в опухолевые клетки. Кроме того, HIF1 способствует метастазированию опухоли в отдаленные и более насыщенные кислородом ткани посредством транскрипционной активации онкогенных факторов роста, таких как трансформирующий фактор роста бета 3 (TGF-вЗ), эпидермальный фактор роста (EGF) и другие (Qi Fang et al., 2006).

1.2. Структура гена HIF1

HIF1 был впервые обнаружен Семенза и сотр. в 1991 году во время исследований, проводимых на гене эритропоэтина (EPO). Данный ген, ответственен за кодирование гормона эритропоэтина участвующего в производстве эритроцитов. Последовательности цис-действующей ДНК (5'- RCGTG-3') были идентифицированы в 3'-фланкирующей области гена EPO. Было обнаружено, что эти последовательности ДНК необходимы для

транскрипционной активации гена EPO в ответ на гипоксию, и поэтому они были названы элементами ответа на гипоксию (HRE) (Zhang, 2018). Дальнейшие исследования показали, что активация транскрипции многих регуляторных генов инициируется посредством связывания специфического белка, который индуцируется в условиях гипоксии с HRE. Позже этот белок был идентифицирован как HIF1 (Carroll, 2006).

Заключение

Успехи в терапии гипоксических состояний связаны с внедрением в медицинскую практику группы лекарственных препаратов, объединенных названием «антигипоксанты». Препараты с антигипоксическим действием все чаще назначают в составе комбинированной фармакотерапии в различных областях клинической медицины, особенно широко их используют при сердечно-сосудистых заболеваниях в кардиологии и неврологии. Однако имеющийся арсенал лекарственных средств с антигипоксическим действием не отвечает в полной мере современным требованиям доказательной медицины, а большинство применяемых препаратов относятся к категории «с недоказанной терапевтической эффективностью» (Carroll, 2016). В последние годы благодаря успехам молекулярной биологии и экспериментальной фармакологии вскрыты фундаментальные механизмы формирования состояния гипоксии различного генеза и индуцируемых ею нарушений метаболических и функциональных процессов на уровне клетки и субклеточных структур. Выявлен ряд морфофункциональных объектов, принимающих непосредственное участие в развитии срочной и долговременной адаптации клетки и всего организма к гипоксии. Эти объекты могут выступать специфическими мишенями для воздействия фармакологических агентов с целью регуляции процессов адаптации организма к гипоксии, что открывает перспективные возможности поиска и разработки новых эффективных лекарственных средств с антигипоксическим действием (Новиков, 2013).

Сегодня в свете проблемы гипоксии большое внимание уделяют специфическому регуляторному белку HIFla. Показано, что этот фактор играет главную роль в системном ответе организма на гипоксию, синтезируется во многих тканях организма, в том числе в нервной ткани, где его экспрессия максимальна в нейронах. Фактор HIFla ответственен за формирование основы долговременной адаптации к гипоксии, путем регуляции экспрессии генных продуктов, включающихся в различные клеточные процессы, а потому представляется удобной мишенью для фармакологического воздействия. Так, повышение экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) через активацию HIFla индуцирует образование новых кровеносных сосудов в области ишемии мозга и сердца, усиливая кровоток и кислородное обеспечение, тем самым уменьшая ишемию. Поэтому поиск активаторов экспрессии HIFla также актуален, как и изучение влияния известных препаратов-антигипоксантов на уровень этого информативного при гипоксии фактора (Колясникова, 2018).

Такой подход открывает новые направления поиска эффективных лекарственных средств направленного регулирования процессов срочной и долговременной адаптации организма к гипоксии и является актуальным в лечении онкологических, ревматических, сердечно-сосудистых и других заболеваний, в генезе которых имеют место состояния гипоксии и ишемии.

Список литературы

1. Агаджанян, Н.Н. Основы физиологии человека / Н.Н. Агаджанян. - М.: РУДН, 2000. — 408 с.

2. Асметов, В.Я. Ноотропы - препараты коррекции амнестических и гипоксических нарушений / В.Я. Асметов, Р.А. Ахундов // Биомедицина. - 2005. - №3. - С. 10-14.

3. Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. - М.: Медицина, 1998. - 599 с.

4. Бойко, С.С. Региональная и субклеточная локализация ЦПГ в мозге крыс / С.С. Бойко [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149. - №6. - С. 648-650.

5. Бочкарева, Н. В. Инсулиноподобные факторы роста и связывающие их белки в патогенезе рака эндометрия / Н.В. Бочкарева [и др.] // Сибирский онкологический журнал. - 2008. - №3. - С. 86-93.

+ еще 62 источника

Примечания

Оригинал в pdf