«Выявление генов ферментативной инактивации ксенобиотиков у бактерий, выделенных из техногенных почв» - Дипломная работа

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. УСТОЙЧИВОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ К КСЕНОБИОТИКАМ 8

1.1. Устойчивость к ксенобиотикам в природе 8

1.2. Распространение устойчивости микроорганизмов к абиотическим веществам 10

1.2.1. Антибиотики в окружающей среде 10

1.2.2. Распространение генов устойчивости к

антибиотикам 12

1.3. Ферментативная инактивация как средство защиты бактерий 16

1.4. Характеристика устойчивости к хлорамфениколу 17

1.5. Общность резистома почвенных бактерий и патогенов человека 19

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23

2.1. Культивирование исследуемых штаммов бактерий 23

2.2. Приготовление препаратов нуклеиновых кислот для ПЦР- анализа 24

2.3. Подбор праймеров и условий для ПЦР-анализа 24

2.4. Электрофоретический анализ амплификатов ДНК 26

2.5. Моделирование структуры белков САТ 26

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 27

3.1. Молекулярно-генетический анализ генов устойчивости к антибиотикам у бактерий, выделенных из техногенных зон 27

3.2. Моделирование структуры белка САТ 33

3.3. Обсуждение результатов 34

Глава 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ «БИОЛОГИЯ» 36

4.1. Место биологии в школьном образовании 36

4.2. Применение материала выпускной квалификационной работы в школьном курсе «Биология» 38

4.3. Разработка урока по биологии на тему «Роль бактерий в 46 природе и жизни человека» для 5 класса 56

4.4. Применение логико-смысловой модели в образовательном процессе (педагогические методы) 59

ВЫВОДЫ 60

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 61

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 73

ППРИЛОЖЕНИЕ

Введение

Актуальность. Ксенобиотики, будучи веществами, не участвующими в циклах метаболизма бактерий, должны являться источниками энергии для их жизнедеятельности. Ферменты трансформации чужеродных клетке молекул -антибиотиков, являются экстренными инструментами реакций, требуемых для поддержания гомеостаза бактериальной клетки. Гены индуцибельных ферментов экспрессируются, когда в среде появляется редкий субстрат, который может стать источником энергии.

Первые устойчивые к антибиотикам штаммы были открыты в клинических условиях. С тех пор изучение механизмов антибиотикорезистентности ограничивались патогенными

микроорганизмами. Развитие устойчивости к антибиотикам является естественным экологическим эволюционным процессом, а гены антибиотикорезистентности являются продуктом миллиардов лет эволюции. Исследования микроорганизмов из нетронутых мест, включая изолированные пещеры и вечную мерзлоту, показали, что резистентность возникает при отсутствии человеческого влияния (Blair et al., 2014).

Было обнаружено множество примеров сходных нуклеотидных последовательностей генов устойчивости почвенных бактерий с распространенными патогенами человека. Для определения распространения устойчивости в окружающей среде требуется более глубокое

профилирование экологических резервуаров для микроорганизмов и их генотипов (Forsberg et al., 2012). Понимание генетической основы бактериальной устойчивости, а, следовательно, и спектра активности антибиотика может направлять разработку новых комбинаций препаратов с улучшенной или расширенной активностью против целевых микроорганизмов (Blair et al., 2014).

Загрязненность почв играет роль создателя селективного давления на микробные сообщества, что может способствовать совместному выбору генов деструкции и генов антибиотикорезистентности. Способность антропогенного воздействия действовать как идеальная среда для стимулирования переноса генов между бактериями дает потенциал для увеличения встречаемости генов антибиотикорезистентности (ARGs) в пределах популяция бактерий и увеличивает скорость переноса генов устойчивости от природных бактерий к патогенам или от одного патогена другому (Ham et al., 2012).

Учитывая растущие количество доказательств того, что клиническая устойчивость тесно связана с экологическими (природными) ARGs и бактериями, ясно, что в исследования должны быть включены непатогенные и природные микроорганизмы (Motlagh et al., 2015).

Научная новизна. Выполнен поиск генетических детерминант устойчивости к хлорамфениколу у бактерий-деструкторов, вновь выделенных из образцов почв техногенных экотопов Республики Башкортостан.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные распространенности антибиотикоустойчивых бактерий могут быть использованы при организации локального бактериального мониторинга природных экотопов, способствующего сдерживанию распространения антибиотикорезистентных микроорганизмов. А также изучение механизмов ферментативной инактивации ксенобиотиков открывает новые возможности для разработки методов биологической очистки среды.

Апробация.

1) Галяутдинова, Ю.А. Гены резистентности бактерий к антибиотикам / Ю.А. Галяутдинова // Форум молодых ученых. - 2018. - № 12-2

(28), С. 53-59.

2) Стариков, С. Н. ПЦР анализ кодирующего монооксигеназу гена tbmD у бактерий - деструкторов хлорароматических производных / С.Н. Стариков, А.И. Сагитова, Л.И. Якшидавлетова, М.Н. Дмитриев, А.П. Чижкова, Ю.А. Галяутдинова, Т.В. Маркушева // Экобиотех. - 2018. - Т. 1, № 4, С. 186-190.

3) Стариков, С. Н. ПЦР-анализ кодирующего монооксигеназу гена tbm / С.Н. Стариков, А.И. Сагитова, Л.И. Якшидавлетова, А.П. Чижкова, Ю.А. Галяутдинова, Т.В. Маркушева // Доклады башкирского университета. - 2018. - Т. 3, № 6, С. 626-630.

Цель: выявить гены антибиотикорезистентности у бактерий,

выделенных из техногенных зон, для последующего применения результатов исследования при разработке методов ремедиации среды нового поколения.

Задачи:

1) Провести отбор штаммов, которые будут включены в исследование, и получить их ДНК-препараты;

2) Осуществить ПЦР-детекцию гена catA1, кодирующего

ферментативную инактивацию хлорамфеникола, у исследуемых бактерий;

3) Создать модели трех типов ферментов

хлорамфениколацетилтрансферазы с помощью гомологичного

моделирования на автоматизированном сервере SWISS-MODEL для указания степени их идентичности;

4) Разработать рекомендации по применению материалов ВКР в школьном курсе «Биология»;

5) Систематизировать материал ВКР с помощью логико-смысловой модели.

Благодарность. Работа выполнена в лаборатории прикладной микробиологии Уфимского Института биологии РАН. Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории за оказание практической помощи при выполнении дипломной работы, а также Горбуновой Валентине Юрьевне и Маркушевой Татьяне Вячеславовне за предоставленную возможность работать в данном направлении.

Выдержка из текста работы

Глава 1. УСТОЙЧИВОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ К КСЕНОБИОТИКАМ

1.1. Устойчивость к ксенобиотикам в природе

Реакции между разнообразными соединениями живой клетки образуют строго определенные метаболические пути, характерные для данной клетки. Уникальный набор ферментов, который генетически запрограммирована производить клетка, определяет ее индивидуальность. Неотъемлемой частью микроорганизмов являются также их вторичные метаболиты. Они не участвуют в вегетативном росте культуры-продуцента и синтезируется после прекращения роста (Ленгелер и др., 2005). К вторичным метаболитам относятся и антибиотики, которые позволяют успешно сосуществовать продуценту в сообществе. Образование клеткой определенного антибиотика не является строго видоспецифичным признаком (Сазыкин и др., 2008). Данные микробные продукты обеспечивают доминирование путем избирательного подавления различных метаболических процессов у других микроорганизмов. Но клетки-продуценты обладают устойчивостью к ним. Механизмы устойчивости продуцентов к собственным метаболитам часто являются индуцибельными, но могут быть и конститутивными (Ленгелер и др., 2005).

Способность образовывать вторичный метаболит может быть утрачена клеткой без последующих последствий или иногда может ускорять рост. Время активации вторичного метаболизма детерминировано генетически. Но изменение внешних условий несомненно влияет на экспрессию соответствующих генов (Ленгелер и др., 2005).

Но для некоторых микроорганизмов антибиотики являются чужеродными веществами и никак не участвуют в метаболизме клетки. Ксенобиотики - это химические вещества, чуждые живому организму. Доминирующее средство трансформации и деградации ксенобиотических соединений на Земле - это биодеградация, производимая микроорганизмами.

Ксенобиотические загрязнители могут стать доступными для микроорганизмов в различных средах окружающей среды (Ленгелер и др., 2005).

Ксенобиотики, будучи веществами, не участвующими в циклах метаболизма бактерий, должны являться источниками энергии для их жизнедеятельности. В данном случае ферменты трансформации антибиотиков являются экстренными инструментами реакций, требуемых для поддержания гомеостаза. Гены индуцибельных ферментов экспрессируются, когда в среде появляется редкий субстрат, который может стать источником энергии.

Сосуществование групп продуцентов антибиотика и не продуцентов также привели к ко-эволюции механизмов устойчивости. В последние годы детерминанты устойчивости обнаружены в данных двух группах бактерий. Они привлекли значительное внимание из-за их возможной причастности в появлении устойчивости у патогенных клинических изолятов. За 70 лет широкого применения антибиотиков скорость, с которой мобилизуются эти гены, увеличилась (Peterson and Kaur, 2018).

Теория роли почвенного резистома основана на убеждении, что продуцирование и устойчивость антибиотиков сосуществуют в почвенных бактериях. Это было продемонстрировано исследованиями путей биосинтеза антибиотиков и анализа генома. Теория основывается на идее, что без гена устойчивости бактерии, продуцирующие антибиотик, будут

самоуничтожаться при производстве антибиотика. Наиболее устойчивые по своей природе бактерии имеют неклиническое происхождение (например, почва), которые с меньшей вероятностью имеют селективное давление антибиотиков, эквивалентное больничным. Это говорит о том, что основная физиологическая роль элементов, вовлеченных в формирование резистентности, заключается не в придании устойчивости к антибиотикам (Walsh and Duffy, 2013).

Гены устойчивости к антибиотикам существовали в микробных сообществах всегда. Практически все противомикробные препараты имеют химическое сходство с природными соединениями. Гены резистентности к ним были найдены в вечной мерзлоте и возникли задолго до способности человечества синтезировать антибиктериальные препараты и массово использовать их. Известно, что некоторые ARGs являются частью древнего почвенного микробиома (D'Costa et al., 2011). Таким образом, резистентность в популяциях является в значительной степени предсказуемым явлением: чем чаще используется антимикробное соединение, тем больше вероятность того, что устойчивость появится и будет поддерживаться в подвергавшейся воздействию микробной популяции (Baker et al., 2018). Антибиотики играют роль селективных факторов отбора резистентных к ним бактерий (Сазыкин и др., 2008).

Заключение

В настоящей работе произведен поиск гена устойчивости к хлорамфениколу catA1 у бактерий-деструкторов. CAT I играет важную роль в устойчивости к антибиотикам многих патогенных бактерий. Есть сведения об использовании его в качестве биохимического и белкового инструмента в ряде систем важных в изучении лекарственной устойчивости. В биотехнологии catA1 является маркером устойчивости к хлорамфениколу плазмид (Biswas et al., 2012).

Устойчивость к хлорамфениколу также может быть опосредована ферментами, которые кодируются генами catA2 и catA3. Для выяснения их сходства с помощью биоинформатичексих методов были построены структуры их белков. Выяснилось, что идентичность нуклеотидной последовательности между тремя генами, а также последовательностей их аминокислот в белках имеет высокую степень.

Анализ структуры и функциональных особенностей ферментов - мишеней разных классов антибиотиков, позволит выработать новые стратегии преодоления резистентности (Егоров и др., 2018). А изучение экологических резервуаров генов устойчивости к

ксенобиотикам/антибиотикам, механизмов и стратегий их распространения, работы продуктов данных генов позволят применить полученные знания в технологиях ремедиации окружающей среды.

Список литературы

1. Акшенцева, О. А. Использование логико-смысловых моделей для повышения познавательной самостоятельности учащихся / О.А. Акшенцева // История. Все для учителя! - 2014. - №11(35), С. 5-7.

2. Баширова, Э. В. Преподавание биологии в 2016-2017 учебном году: методические рекомендации / сост.: Уфа: ГАУ ДПО ИРО РБ, 2016. / Э.В. Баширова, А.Н. Митриченко - Уфа: ГАУ ДПО ИРО РБ. - 2016. - 22 с.

3. Егоров, А. М. Бактериальные ферменты и резистентность к антибиотикам / А.М. Егоров, М.М. Уляшова, М.Ю. Рубцова // Acta Naturae. - 2018. -Т. 10, № 4 (39), С.33-48.

4. Ленгелер, Й. Современная микробиология: Прокариоты / под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. - М.: Мир, - 2005. - 496 с.

5. Матвеева, А. В. Особенности преподавания биологии в 2017-2018 учебном году: методические рекомендации [Электронный ресурс] / А.В. Матвеева - Кемерово, 2017. - 23 с. - Режим доступа: www.imc-mmr.u**z.ru. - (Дата обращения: 15.04.2019).

+ еще 71 источник

Примечания

Оригинал в pdf