«Сравнительный анализ генов оксигеназ бактерий» - Дипломная работа

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 4

Глава 1.ОБЗОР НАУЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Применение методов ДНК-типирования в микробиологии 8

1.2. Ксенобиотики: особенности и роль в биосфере 10

1.3. Конверсия ксенобиотиков с помощью микроорганизмов 11

1.4. Г енетические особенности микроорганизмов деструкторов 13

1.5. Скрининг генов оксигеназ методом ПЦР 14

Глава 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 16

2.1. Объекты исследований 16

2.2. Методы исследования 17

2.2.1. Приготовление питательных сред 19

2.2.2. Методы стерилизации 20

2.2.3. Методы посева бактерий 21

2.2.4. Выделение бактериальной геномной ДНК 22

2.2.5. ПЦР-анализ генов xylM,tbmD и xylA 22

2.2.6. Электрофорез геномной ДНК в агарозном геле 23

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 25

3.1. Рост штаммов на селективных средах 25

3.2. Сравнительная характеристика генов xylA, xylM и tbmD 27

3.3. Пцр-анализ генов xylM, tbmD и xylA,кодирующих монооксигеназу 31

Глава 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВНЕДРЕНИЮ МАТЕРИАЛОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В КУРСАХ БИОЛОГИИ ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ 35

1.1. Основы исследований в лаборатории микрооргпнизмов 35

1.2. Анализ программ и учебников на представление материала ВКР 43

1.3. Использование логико-смысловой модели в процессе изучения школьного курса биологии 51

1.4. Логико-смысловая модель 53

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 55

ВЫВОДЫ 56

ЛИТЕРАТУРА 57

Введение

Актуальность темы.

Стремительные темпы развития народного хозяйства приводят к появлению во внешней среде огромного количества разнообразных химических соединений, которые негативно влияя на живую природу, несут угрозу для человека и животных, а некоторые из них, например, хлорированные феноксиуксусные кислоты, применяемые в качестве пестицидов и гербицидов, используются непосредственно из-за своей токсичности. Поступая в окружающую естественную среду, хлорированные

феноксиуксусные кислоты способны вызвать аллергические реакции, влиять на наследственность, изменять обмен веществ и ход естественных процессов в экосистемах (Боронин,1989). Известно, что некоторые микроорганизмы способны осуществлять ассимиляцию разнообразных химических субстанций, в ходе которых выполняются процессы конверсии молекул ксенобиотиков до экологически безопасных продуктов ( Sorensen et al., 2006). В целом биодеградация ксенобиотиков зависит от многих факторов: химической природы соединений, физико-химических условий среды, возможности микроорганизмов применять ксенобиотики в качестве субстрата (Ижевский, 2006). Современные биологические методы защиты среды основаны на применении микроорганизмов деструкторов, имеющих не только системы акцептирования и превращения молекул загрязнителей в безвредные формы, но и также способные расщеплять токсичные соединения (Березин,2013).

Цель данной работы - выявление генетических особенностей штаммов - деструкторов хлорароматических производных родов Achromobacter,

Pseudomonas,Rhodococcus и Xantomonas для последующего применения в целях очистки окружающей среды

Задачи:

1) получить биомассу чистых культур микроорганизмов на минимальной среде с добавлением хлорароматических производных в качестве единственного источника углерода и энергии;

2) выделить препараты геномной ДНК из клеток изучаемых штаммов;

3) провести ПЦР-анализ генов оксигеназ с применением высокоспецифичных праймеров генов xylM, xylA и tbmD.

4) разработать материалы для применения данной выпускной квалификационной работы в программе курса биологии высшей школы.

Научная новизна. Получены новые данные об особенностях организации геномов вновь выделенных бактериальных деструкторов из промзоны г.Уфы Республики Башкортостан родов Achromobacter, Pseudomonas,Rhodococcus и Xantomonas.

Практическое значение исследования. Результаты изучения генов, контролирующих ферменты, катализирующие расщепление ароматического кольца, раскрывают генетическое разнообразие микроорганизмов и расширяют возможности рационального применения микробов в технологиях охраны окружающей среды нового поколения.

Апробация.

1. Стариков С.Н., Дмитриев М.Н., Саетова К.У. Изучение бактериальных генов, контролирующих конверсию ароматических загрязнителей // 21-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» (17- 21 апреля) / Пущино. Сборник материалов, 2017 г. - С 43-44

2. Стариков С.Н., Дмитриев М.Н., Саетова К.У. Сравнительный анализ бактерий-деструкторов хлорароматических загрязнителей // Материалы докладов V Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием (25 марта 2017 г.) / г. Махачкала, Россия: ДГПУ, Планета - Д, 2017 г. - С 207-209

3. Дмитриев М.Н., Стариков С.Н., Маркушева Т.В. ПЦР-АНАЛИЗ гена xylM, кодирующего монооксигеназу // Материалы Всероссийской (с международным участием) студенческой научно- практической конференции «Наука 2020» (19 апреля 2017 г.) / Уфа. Изд-во БГПУ, 2017. - стр 175-178

4. Стариков С.Н., Якшидавлетова Л.И., Сагитова А.И., Дмитриев М.Н. ПЦР анализ штаммов - деструкторов хлорароматических производных // В книге Актуальные вопросы современного химического и биохимического материаловедения Материалы V Международной молодежной научно-практической школы конференции. Башкирский государственный университет; отв.ред.О.С.Куковинец.2018.С.264-267.

Выражаю искреннюю благодарность профессору Горбуновой Валентине Юрьевне за предоставленную возможность работать в данном научном направлении, профессору Маркушевой Татьяне Вячеславовне за помощь при выполнении дипломной работы. Также выражаю благодарность всем сотрудникам кафедры генетики.

Выдержка из текста работы

1.3 Конверсия ксенобиотиков с помощью микроорганизмов

В биодеградации ксенобиотиков у микроорганизмах обычно участвует несколько ферментов. Кодирующие их гены, могут быть расположены в хромосоме, но чаще входят в состав крупных плазмид, а иногда обнаруживаются как в хромосомной, так и в плазмидной ДНК.

К настоящему моменту установлено, что использование плазмидсодержащих штаммов способствует интенсификации процессов очистки

нефтезагрязненных сред за счет передачи плазмид и генов биодеградации, что ведет к увеличению числа клеток, содержащих плазмиды, и расширению спектра утилизируемых субстратов.

Плазмиды представляют собой линейную или кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК, содержанию от 1500 до 40000 пар нуклеотидов. Плазмиды, детерминирующие процессы деградации ксенобиотиков, получили название Д-плазмид. Большинство из них найдено у бактерий рода Pseudomonas. Они способны контролировать деградацию таких соединений, как ксилол, толуол, нафталин, камфора, 2.4-Д и др. Локализация генов биодеградации в плазмидах дает возможность конструирования новых штаммов микроорганизмов, способных к деградации нескольких ксенобиотиков.

В зависимости от способности передаваться в процессе конъюгации из одной бактериальной клетки в другую выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды (Waters, 2001).

Для повышения способности микроорганизмов к биодеградации используют технологии рекомбинантных ДНК, традиционного мутагенеза и методов отбора.

Так, например, путем рекомбинации генов двух штаммов Pseudomonas был получен штамм, способный расти на 5 ароматических соединениях. Приспособление микроорганизмов к изменяющимся условиям среды включают разные процессы: горизонтальный перенос генов, дупликации, инверсии, инсерции и др (Раутин, 2002). Горизонтальный перенос генов является главным «инструментом» быстрого приобретения и возникновения новых генов, которые способны радикально изменить свойства клеток, расширить их адаптационный потенциал (Шестаков, 2003). Наибольшее количество переносов характерно для свободноживущих бактерий с широкими экологическими ареалами, наименьшее - у патогенных бактерий, живущих в узких эконишах (Марков, 2008).

Получение“незнакомых”генов может изменить направленность эволюции видов, сильно воздействовать на фенотип вида, на его возможность к приспособлению в экологическом сообществе. Отличающийся ген может дать начало новой популяции, которая может вытеснить предыдущий вид. Это явление, в котором организм передаёт ДНК иному организму, способствует стремительному увеличению процесса эволюции (Шестаков, 2003).

1.4 Генетические особенности микроорганизмов деструкторов

Основной группой микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики, являются бактерии, разные штаммы которых способны расщеплять достаточно большое количество органических соединений.

Аэробные бактерии рода Pseudomonas — значимая в научном и практическом отношении гетерогенная группа микроорганизмов, которая широко населяет биосферу и принимает активное участие в процессах минерализации органических соединений, а также очистке окружающей среды от загрязнения. Бактерии рода Pseudomonas достаточно часто встречаются в окружающей среде. Обнаружить их можно в воздухе, грунте, морских и пресных водоемах, сточных водах иле, нефти и на газовых месторождениях. Бактерии этого рода широко используются в сельском хозяйстве, а также в качестве моделей для многих теоретических исследований.

Представители рода Rhodococcus широко распространены в природе и выделяются из водных ( грунтовых, поверхностных, сточных) и почвенных биотопов, связанных, в частности, с месторождениями нефти и газа ( Нестеренко, 1985). Обладая уникальными биологическими свойствами в том числе, широкими катаболическими возможностями и уникальными ферментными системами, родококки могут деградировать разнообразные по химической структуре ксенобиотики (Larkin, 2005). Эти особенности в сочетании со способностью выживать в неблагоприятных условиях среды делают представителей рода Rhodococcus перспективными при разработке биокатализаторов и биопрепаратов для ремидиации загрязненных углеводородами объектов окружающей среды. Биодеструктирующие свойства бактерий рода Rhodococcus ( взаимодействие с гидрофобными субстратами и окисление их широкого спектра) обусловлены наличием липофильной клеточной стенки, которая с одной стороны, обладает высоким сродством к углеводородам и обеспечивает взаимодействие с ними, а с другой, выполняет барьерную функцию для крупных молекул, в том числе антибиотиков ( Bell, 1998). Разнообразие катаболических путей, позволяющих родококкам метаболизировать широкий круг соединений, обусловлено большим размером их генома, который включает плазмиды - от маленьких кольцевых до больших линейных, на которых расположено большое число катаболических генов, а также генов устойчивости и вирулентности( Larkin, 2010). Для представителей рода Rhodococcus характерно наличие генных кластеров, включающих хромосомы и несколько плазмид или только плазмиды, между которыми рассредоточены гены деградации, что также является важным фактором катаболического разнообразия и универсальности ( Larkin, 2006).

Заключение

Микробные клетки способны осуществлять ассимиляцию разнообразных химических субстанций, в ходе которых выполняются процессы конверсии молекул ксенобиотиков до экологически безопасных продуктов. Получены новые данные об особенностях организации геномов вновь выделенных бактериальных деструкторов промзоны г.Уфы Республика Башкортостан родов Achromobacter 36P, Pseudomonas 3D, Rhodococcus 1D и Xantomonas 2D. Методом ПЦР установлено, что в геномах вновь выделенных штаммов - деструкторов хлорароматических производных отсутвуют гомологи генов xylA, tbmD, xylM Pseudomonas putida mt-2 (Paw1). Применение микроорганизмов, способных к конверсии загрязнителей промышленного ряда, открывает возможности безопасной утилизации промышленных объемов экотоксикантов. Результаты изучения генов, контролирующих ферменты, катализирующие расщепление ароматического кольца расширяют возможности рационального применения микробов в технологиях охраны окружающей среды нового поколения.

Список литературы

1. Анисимова Л.Г. Бактериальные штаммы для ремедиации почв, загрязненных органическими токсикантами / Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на пути к инновациям материалы I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Москва, 2008. С. 8-9.

2. Березин Г.И. Комплексная оценка микробиологического состояния почвы при хроническом и остром действии пестицидов/ Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук // - Сыктывкар, 2013.

3. Боронин А.М. Цой Т.В. Генетические системы биодеградации: Организация и регуляция экспрессии // Генетика. - 1989. - Т. 25 - С. 581-594;

4. Бикбулатова С.М. Микробиология. Лабораторный практикум / Сост. С.М. Бикбулатова. - Уфа: Изд-во БГПУ, 2004. - 56с.;

5. Вашков В. И. Средства и методы стерилизации, применяемые в медицине, М., 1973;

+ еще 41 источник

Примечания

Оригинал в pdf