«Детекция детерминант устойчивости к ксенобиотикам у штаммов бактерий, выделенных из техногенных почв» - Дипломная работа

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. ПРОБЛЕМА РАСПРОСТРАНЕНИЯ И ФОРМИРОВАНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 8

1.1. Ксенобиотики. 8

1.2. Открытие антибиотиков и их значение 9

1.2.1. Общая характеристика класса тетрациклины 12

1.3. Устойчивость почвенных бактерий к антибиотикам 13

1.4. Механизмы устойчивости к тетрациклинам у микроорганизмов 17

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 23

2.1. Объекты исследования 23

2.2. Методы исследования 25

2.2.1. Приготовление питательных сред и условия культивирования 25

2.2.2. Методы посева бактерий 25

2.2.3. Определение антибиотикоустойчивости 26

2.2.4. Выделение бактериальной ДНК 27

2.2.5. Определение генетических маркеров АБР методом ПЦР 27

2.2.6. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле 28

2.3. Биоинформатические методы 29

2.3.1. Моделирование белка c использованием компьютерных программ.29

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 30

3.1. Исследование антибиотикорезистентности у бактерий-деструкторов 30

3.2. Детекция детерминант устойчивости к классу тетрациклинов 34

3.3. Моделирование структуры белков с использованием компьютерных программ 39

Глава 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ «БИОЛОГИЯ» 41

4.1. Роль биологии в школьном образовании 41

4.2. Применение материала выпускной квалификационной работы в школьном курсе «Биология» 43

4.3. Разработка урока по биологии на тему «Строение и жизнедеятельность бактерий» для 5 класса 47

4.4. Применение логико-смысловой модели в образовательном процессе 56

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 58

ВЫВОДЫ 59

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 60

ПРИЛОЖЕНИЕ 68

Введение

Актуальность темы. Открытие и использование антибиотиков для лечения бактериальных инфекций у животных, растений и человека представляет собой одно из наиболее значимых открытий 20-го века.

Механизмы действия антибиотиков и механизмы устойчивости к антибиотикам изучались исключительно у патогенных бактерий. Только в последние годы исследования устойчивости к антибиотикам были сосредоточены на окружающей среде, из которой первоначально были получены антибиотики: почвенные микроорганизмы и почвенная экосистема. С увеличением резистентности к антибиотикам и появлением бактерий с множественной устойчивостью исследования начали фокусироваться на изучении природной резистентности к антибиотикам и эволюции устойчивости к антибиотикам в неклинической среде с целью выявления резервуаров как известных, так и новых механизмов устойчивости к антибиотикам.

Почвенные бактерии, обладающие антибиотикорезистентностью, играют важную роль в эволюции развития и распространения устойчивости к антибиотикам, но мало проведено исследований о естественном бактериальном резистоме в почве.

Ученые подчеркивают важность исследований резистома почвы и механизмов передачи АРГ. Понимание этого позволит сохранить антибиотики для лечения инфекционных заболеваний, а также понять эволюцию развития устойчивости к антибиотикам и ее распространение между видами и биомами (Pruden et al., 2006; Aminov, 2009).

Тем не менее, на сегодняшний день проведено мало исследований, в которых изучался культивируемый резистом почвы, и все эти исследования были ограничены бактериями Streptomyces, которые продуцируют антибиотики (Bhullar et al., 2012).

Изучение окружающего микробного мира потенциальных механизмов устойчивости и распространения антибиотиков может помочь в разработке мер раннего предупреждения и профилактических мер для поддержания эффективности антимикробных препаратов и химиотерапии.

Цель: выявление детерминант устойчивости к антибиотикам у

бактерий-деструкторов, выделенных из техногенных почв для последующего применения полученных данных в разработках методов очистки окружающей среды.

Задачи:

1. Определить диско-дуффузионным методом резистентность к антибиотикам исследуемых штаммов бактерий, выделенных из почв техногенных зон.

2. Выделить ДНК из клеток исследуемых бактерий-деструкторов для проведения молекулярно-генетического анализа.

3. Провести ПЦР анализ с применением праймеров к гену tetC, кодирующего устойчивость к классу тетрациклинов.

4. Построить модель трёхмерной структуры белка TetC, ответственного за резистентность к тетрациклину.

5. Разработать методические рекомендации по использованию результатов выпускной квалификационной работы в школьном курсе «биология».

6. Построить логико-смысловую модель по результатам исследования и к уроку по теме «Строение и жизнедеятельность бактерий».

Научная новизна.

Впервые штаммы бактерий-деструкторов исследованы на наличие генетических детерминант устойчивости к тетрациклину у штаммов бактерий-деструкторов, выделенных из образцов почв техногенных экотопов Республики Башкортостан.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные данные могут быть использованы для понимания распространенных типов устойчивости современных бактерий к классу тетрациклинов, а также применены при организации локального бактериального мониторинга природных экотопов способствующего сдерживанию распространения антибиотикорезистентных микроорганизмов.

Публикации. Результаты работы были опубликованы в журналах, индексируемых в РИНЦ:

1. Чижкова А.П. Гены резистентности к антибиотикам у бактерии staphylococcus aureus: обзор литературы / А.П. Чижкова // Форум молодых ученых. - 2018. - №9, С. 834-843.

2. Чижкова А.П. Механизмы устойчивости к антибиотикам у бактерии serratia marcescens / А.П. Чижкова // Форум молодых ученых. - 2018. - №12(28), С. 503-506.

3. Чижкова А.П. Эффлюкс механизм и гены резистентности к тетрациклину у бактерий / А.П. Чижкова // Форум молодых ученых. - 2018. - №12(28), С. 506-510.

4. Стариков, С. Н. ПЦР анализ кодирующего монооксигеназу гена tbmD у бактерий - деструкторов хлорароматических производных / С.Н. Стариков, А.И. Сагитова, Л.И. Якшидавлетова, М.Н. Дмитриев, А.П. Чижкова, Ю.А. Галяутдинова, Т.В. Маркушева // Экобиотех. - 2018. - Т. 1, № 4, С. 186-190.

5. Стариков, С. Н. ПЦР-анализ кодирующего монооксигеназу гена tbm / С.Н. Стариков, А.И. Сагитова, Л.И. Якшидавлетова, А.П. Чижкова, Ю.А. Галяутдинова, Т.В. Маркушева // Доклады башкирского университета. - 2018. - Т. 3, № 6, С. 626-630.

Благодарность. Работа выполнена в лаборатории прикладной микробиологии Уфимского Института биологии РАН. Автор выражает благодарность своему научному руководителю Маркушевой Татьяне Вячеславовне и заведующей кафедрой генетики Горбуновой Валентине Юрьевне за предоставленную возможность работать в данном направлении, а также сотрудникам лаборатории за оказание практической помощи при выполнении выпускной квалификационной работы.

Выдержка из текста работы

ГЛАВА 1. ПРОБЛЕМА РАСПРОСТРАНЕНИЯ И ФОРМИРОВАНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Ксенобиотики

Ксенобиотики (от греч. ccvoc — чуждый и в^^ — жизнь) - химические вещества, которые являются чужеродными для организма. К таким веществам относятся синтетические и природные лекарственные препараты, пестициды, промышленные яды, отходы производств, пищевые добавки, косметические средства и прочие (Юрин, 2001).

Антибиотики (и потенциальные метаболиты и продукты трансформации антибиотиков) и другие ксенобиотические соединения могут подвергаться ряду деградационных процессов в водной и в наземной среде, приводящих к диссипации исходного соединения. Если соединение не поддается разложению, то оно остаётся в окружающей среде химически неизменным. Деградация может происходить в результате абиотических или биотических процессов.

Абиотическая деградация антибиотиков и других ксенобиотических соединений происходит в основном путем гидролиза и фотолиза.

Биотическая деградация (биодеградация) описывается как “молекулярная деградация вещества в результате комплексного действия живых организмов”. В результате, микроорганизмы окружающей среды способны использовать ксенобиотические молекулы в качестве субстратов в своем метаболизме (Limbert and Betts, 1996). Микробные сообщества в окружающей среде играют различную роль в разложении органических ксенобиотиков, выступая в качестве деградационных консорциумов. Некоторые члены консорциумов могут быть не в состоянии деградировать определенную молекулу, но могут быть в состоянии биохимически преобразовать ее. Другие члены консорциумов могут быть способны деградировать продукт трансформации по биохимическому пути в рамках своего метаболизма (Pelz et al., 1999).

Воздействие на микробные сообщества ксенобиотиков (которые могут не являться антибиотическими соединениями) может привести к распространению устойчивости к антибиотикам. Основной причиной этого является перемещение мобильных генетических элементов. Перенос мобильных генетических элементов также увеличивает вероятность того, что совместный отбор резистентности произойдет в присутствии общего экологического стрессора.

1.2. Открытие антибиотиков и их значение

Термин "антибиотики" относится к естественно продуцируемым веществам различных микроорганизмов, таких как бактерии или грибы, которые способны ингибировать рост других микроорганизмов и разрушать их клетки. С производством полусинтетических производных в современную эпоху термин "антибиотики" был заменен термином "антимикробные препараты", который относится к природным, полусинтетическим и синтетическим веществам, способным ингибировать пролиферацию микроорганизмов и тем самым приводить их к гибели. До появления антибиотиков человечество было подвержено инфекционным заболеваниям. Такие заболевания, как пневмония, менингит или туберкулез, вылечить было невозможно (Kourkouta et al., 2018).

Инфекции были основной причиной смерти в девятнадцатом веке. Введение антибиотиков не только помогло в лечении инфекций, но также сыграло важную роль в снижении заболеваемости и смертности.

История антимикробных препаратов началась в конце 1890-х годов, когда два немецких исследователя Рудольф Эммерих и Оскар Лоу открыли первое антибактериальное вещество, пиоцианазу, полученное из культивирования бактерии Pseudomonas pyocyanea. Пиоционаза затормаживала развитие возбудителей холеры и тифа (Emmerich R. and Low O. 1899).

В 1909 году Пауль Эрлих разработал первый противомикробный препарат на основе мышьяка, который получил название сальварсан. Он действовал против возбудителя сифилиса - Treponema pallidum. Это открытие заложило основы для дальнейшего развития противомикробных средств (Schwartz, 2004).

Заключение

Данная работа посвящена изучению детерминант устойчивости к ксенобиотикам у бактерий-деструкторов. Было проанализировано 30 штаммов, выделенных из пяти техногенных зон Республики Башкортостан, на наличие антибиотикорезистентности.

Бактериальная резистентность к тетрациклину вследствие приобретения новых генов и / или мутации существующих уже генов увеличилась в течение последних 30 лет. Окружающая среда, несомненно, является важным резервуаром для генов устойчивости. Приобретенные бактериями гены часто связаны с мобильными элементами, которые обеспечивают распространение этих генов в различных бактериальных популяциях и экосистемах.

Фенотипическое проявление признаков резистентности к классу тетрациклинов у исследуемых штаммов может быть обусловлено эффлюкс механизмом при котором происходит выкачивание антибиотика из клетки, механизмом защиты рибосомы, контролируемым 9 генами, кодирующими защитные белки или механизмом устойчивости, модифицирующим тетрациклины за счёт монооксигеназ, способствуя их деградации, кодируемых 11 генами. В настоящей работе произведён поиск гена, обуславливающий устойчивость к тетрациклину, который кодирует эффлюкс белок. Для понимания белковой структуры биоинформатическими методами была построена трёхмерная модель белка TetC.

Если общее использование тетрациклинов, и всех антибиотиков в целом, не изменится, то это может привести к снижению эффективности современных методов лечения.

Список литературы

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов. - 5-е изд., испр. - М.: ООО «Медицинское

информационное агентство», 2016. - 792 с.

2. Глобальный план действий по борьбе с устойчивостью к противомикробным препаратам [Электронный ресурс] // WHO. - 2015. - Режим доступа: https://apps.w**o.int/iris/bitstream/handle/10665/254884/ 9789244509760-rus.pdf?sequence=1. - (Дата обращения: 30.05.2018).

3. Добриневская А.И. Дидактический инструментарий учителя логико- смыслолвые модели / Добриневская А.И., Мещерякова Л.И. - 2009. - №3. - с. 7-12.

4. Ермольева З. В. Биологически активные вещества / З. В. Ермольева. - М.: Знание, 1966. - 32 с.

5. Марданова А. М. Эффлюкс-системы SERRATIA MARCESCENS / А.М. Марданова, Л.М. Богомольная, Ю.Д. Романова, М.Р. Шарипова // Микробиология. - 2014. - Т.83. - № 1. - С.3-14.

+ еще 59 источников

Примечания

Оригинал в pdf