«Молекулярно-генетический анализ роли полиморфизмов в гене эндотелиальной синтазы оксида азота при онкопатологии» - Дипломная работа

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. РОЛЬ ГЕНА eNOS В РАЗВИТИИ ОНКОПАТОЛОГИЙ 8

1.1 Генетическая предрасположенность к онкопатологиям 8

1.2 Роль NO в канцерогенезе 10

1.3 . Структура, локализация и функции гена eNOS 12

1.3.1. Характеристика полиморфного локуса rs2070744 в гене eNOS 15

1.3.2. Характеристика полиморфного локуса rs1799983 в гене eNOS 16

1.3.3. Характеристика VNTR Intron4 в гене eNOS 18

1.4. Заключение 19

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 20

2.1. Материалы исследования 20

2.2. Методы исследования 20

2.2.1. Молекулярно-генетические методы 20

2.2.1.1. Выделение ДНК из венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции 20

2.2.1.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 22

2.2.1.3. ПДРФ-анализ 25

2.2.1.4. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) 25

2.2.1.5. Real-time ПЦР 26

2.3. Методы статистической обработки данных 28

2.3.1. Применение программы SNPStats для статистической обработки данных 28

2.3.2. Определение взаимного влияния генотипов на признак с помощью

редукционного анализа 29

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 30

3.1. Сравнительный анализ генетической структуры исследуемых групп

3.1.1. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs2070744 в гене eNOS в группе больных РМЖ и среди индивидов без патологии

3.1.2. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs1799983 в гене eNOS в исследуемых выборках

3.1.3. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта VNTR Intron4 в гене eNOS в исследуемых выборках

3.1.4. SNP-анализ модели наследования генотипов полиморфных локусов rs2070744, rs1799983, VNTR Intron4 в гене eNOS в группе онкобольных и среди индивидов без патологии

3.1.5. Анализ сочетания генотипов полиморфных вариантов rs1799983, rs2070744 и VNTR Intron4 в гене eNOS

3.1.6. Определение взаимного влияния полиморфных вариантов rs2070744, rs1799983 и VNTR Intron4 в гене eNOS на риск РМЖ с помощью редукционного анализа

Глава 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВНЕДРЕНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ БИОЛОГИИ 30

4.1. Место биологии в школьном образовании 30

4.2. Применение материала выпускной квалификационной работы в

школьном курсе «Биология» 31

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 42

ВЫВОДЫ 43

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 44

ПРИЛОЖЕНИЯ 53

Введение

Несмотря на многолетние усилия теоретической и практической медицины, онкологическая патология остается одной из наиболее важных проблем здравоохранения. Основным аспектом, обусловливающим актуальность изучения онкологических заболеваний, считаются трудности в понимании патогенеза рака, поскольку отсутствие понимания механизмов развития и течения заболевания затрудняет диагностику и снижает эффективность лечения.

Оксид азота (NO) - продукт гена эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) не относится к непосредственным факторам возникновения онкопатологий, тем не менее, в настоящее время он рассматривается как важный регулятор процесса стабилизации первичных опухолей. За период изучения оксида азота накоплен большой объем информации в отношении его значимости, как для нормального функционирования организма, так и для развития патологий различных систем органов. Такие данные получены на биохимическом, клиническом, а в последние годы - и на молекулярно-генетическом уровнях. Увеличение спектра изучаемых полиморфизмов генов, участвующих в формировании предрасположенности к образованию и развитию рака, позволит приблизиться к лучшему пониманию их роли в патогенезе онкологических заболеваний.

Представлены сведения о функциональной роли NO, который является продуктом еNOS, в развитии онкопатологии.

Цель исследования: анализ ассоциации аллелей и генотипов

полиморфизмов в гене эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) с раком молочной железы для определения их маркерной роли при онкопатологии.

В соответствии с целью были выявлены следующие задачи:

1. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs2070744 в гене eNOS в выборке лиц с онкопатологией и среди индивидов без патологии, составляющих контрольную группу.

2. Проанализировать распределения частот аллелей и генотипов

полиморфизма rs1799983 в гене eNOS в исследуемых выборках.

3. Проанализировать распределение частот аллелей и генотипов

полиморфизма Intron VNTR4 в гене eNOS в исследуемых выборках.

4. Провести анализ сочетания генотипов полиморфизмов в гене eNOS в группе индивидов с онкопатологией и среди индивидов без патологии.

5. Определить степень взаимного влияния генотипов полиморфных вариантов в гене eNOS на развитие риска заболеваемости РМЖ.

6. Разработать методические рекомендации по применению результатов исследования в школьном курсе биологии.

Научная новизна работы. Впервые проанализировано распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов rs2070744, rs1799983 и Intron VNTR4 в гене eNOS, которые оказывают влияние на экспрессию NO в эндотелиальных клетках, в группе лиц с онкопатологией и среди здоровых индивидов, составляющих группу контроля.

Практическое значение. Результаты исследования могут

способствовать оценке роли полиморфных локусов в гене eNOS в формировании онкозаболеваний. Предполагается, что данное исследование внесет свой вклад в изучение молекулярно-генетических основ развития и прогрессирования рака молочной железы. Генетические исследования патогенеза рака могут обеспечить ферментные мишени для исследования медицинских препаратов и потенциального лечения.

Апробация. Результаты исследования представлены на ежегодной Межвузовской научной конференции Вавиловские чтения кафедры генетики Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы и опубликованы в сборнике, индексируемом в РИНЦ в виде статьи «Вклад гена NOS3 в патогенез различных заболеваний»/ Туркменова Д.И., Воробьева Е.В.; в сборнике: Вавиловские чтения - 2018 Труды Межвузовской научной конференции молодых ученых, 2018. С. 77-82.

Исследование было выполнено на базе лаборатории центра молекулярно-генетических исследований при кафедре генетики естественно-географического факультета БГПУ им. М. Акмуллы.

Выдержка из текста работы

Глава 1. РОЛЬ ГЕНА eNOS В РАЗВИТИИ ОНКОПАТОЛОГИЙ

1.1 Генетическая предрасположенность к онкопатологиям

На протяжении многих лет онкологическая патология существенным образом влияет на среднюю продолжительность жизни населения и занимает второе место в структуре всех причин смертности после заболеваний системы кровообращения. Согласно сведениям ВОЗ, показатели заболеваемости онкологией демонстрируют ежегодное увеличение частоты выявления новых случаев рака и сейчас рак считается причиной практически каждой шестой смерти в мире. В 2018 г. от этого заболевания умерли 9,6 млн человек (ВОЗ, 2018). В настоящее время в России раком заболевает каждый четвертый индивид, предполагается, что через 10-15 лет будет заболевать каждый третий (Океанов, 2016). Это объясняет пристальное внимание, которое уделяется вопросам, затрагивающим тему заболеваемости населения злокачественными новообразованиями.

Онкология — область медицины, которая изучает всю совокупность процессов, связанных с природой и клиническим проявлением опухолей, и разрабатывает методы их обнаружения, предупреждения и лечения (БМЭ, 1981).

До сих пор не было предложено точной формулировки понятию «опухоль», так как отсутствуют полные сведения о его природе. Существующие определения представляют собой наиболее существенные характеристики опухолевого процесса. На данный момент считается, что опухоль — это обладающее неконтролируемым прогрессирующим необратимым ростом патологическое разрастание атипичных клеток, которые замещают и инфильтрируют здоровые ткани. Понятие «рак» объединяет множество различных форм новообразований. Их отличительной характеристикой является активное формирование атипичных клеток, которые разрастаются за пределы своих нормальных границ. Их способность проникать и распространяться в других тканях и органах называется метастазированием. Данный процесс считается одной из главных причин смерти от опухолей (БМЭ, 1983).

Рак молочной железы (РМЖ) является одной из самых распространенных онкологических заболеваний среди женщин по данным ВОЗ (Adams, 2013). Для рака молочной железы выявлено множество

факторов риска, которые повышают вероятность заболевания, однако остаются неясными механизмы их работы. Значимыми факторами риска РМЖ выступают семейный анамнез заболевания, влияние гормональных факторов, курение (Lu J., 2006) и употребление алкоголя. Отмечена роль окислительного стресса, поэтому важную роль играет также тип питания. В частности, отсутствие или пониженное количество продуктов питания с антиоксидантным действием в рационе вызывает увеличение риска канцерогенеза. Генетические изменения в ферментах, защищающих клетки от действия активных форм кислорода и метаболизирующих канцерогены, также влияют на риск заболевания (Christine et al., 2008).

В ходе многоэтапного процесса возникновения атипичных клеток, предраковое поражение переходит в форму злокачественного образования. Считается, что преобразование нормальных клеток в атипичные происходит вследствие взаимодействия генетических и внешних факторов. Последние группируются в три категории факторов:

• химические канцерогены, например, составные табачного дыма, асбест и др.;

• физические канцерогены, например, ионизирующее и ультрафиолетовое излучение;

• биологические канцерогены, к которым относятся инфекции, вызываемые некоторыми бактериями, паразитами или вирусами.

Тем не менее, основными факторами, запускающими процесс новообразования, считаются генетические изменения (Loktionov, 2004). Большая часть мутаций, вызывающих рак, являются спорадическими, а не наследственными. Они обладают определенной частотой проявления, однако не имеют закономерного пути, определяющего их природу и физиологическое содержание. Это является причиной возникновения точки зрения о непредсказуемости природы опухолей и об отсутствии закономерного пути их происхождения (БМЭ, 1983; ВОЗ, 2018).

Заключение

В данном исследовании рассматривается вопрос о молекулярно-генетических основах онкологических заболеваний, в частности, рака молочных желез. Были исследованы две группы индивидов: одну выборку составляли индивиды с установленным диагнозом рака молочных желез (94 индивида), другая группа была представлена лицами без онкологического диагноза (69 индивидов).

В ходе исследования было изучено распределение аллелей и генотипов по полиморфным вариантам rs2070744, rs1799983 и VNTR Intron4 в гене eNOS в выборке лиц с диагностированным РМЖ и в выборке индивидов без данной патологии. Выявлены аллели и генотипы, нарушающие случайное распределение в данных выборках.

Анализ сочетания генотипов полиморфных вариантов в гене eNOS c использованием программы для статистической обработки данных SNPStats и таблицы сопряженности 2х2 с поправкой Йетса на непрерывность не выявил достоверного преобладания какого-либо из сочетаний аллелей или генотипов в обоих группах (p>0,05).

Редукционный анализ показал отсутствие статистически значимого совместного влияния в формирования риска РМЖ сочетаний генотипов полиморфизмов в гене еNOS

Таким образом, учитывая двойственные литературные данные, нельзя исключать роль гена eNOS как предиктивного при заболевании РМЖ. Вопрос требует дальнейшего изучения с учетом некоторых дополнительных условий, так как регуляция экспрессии гена eNOS факторами внешней среды и роль физиологических параметров индивидов. Актуально продолжение исследования в выборках с большим количеством исследуемых участников.

Список литературы

1. Акименко В. М. Новые логопедические технологии: учебно-метод. пособие Ростов н/Д: Феникс, 2008. — 105 с.: ил.

2. Анализ таблиц сопряженности 2х2 с вычислением статистик связи (с поправкой Йэйтса) [Электронный ресурс] / Режим доступа: http://www.biometrica.tomsk.ru/freq2.htm/, свободный. - Загл. с экрана. -яз. рус.

3. База данных «GeneCards» [Электронный ресурс] / Режим доступа: https://www.genecards.org/, свободный. - Загл. с экрана. - яз. англ.

4. База данных «The National Center for Biotechnology Information (NCBI)» [Электронный ресурс] / Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, свободный. - Загл. с экрана. - яз. англ.

5. Биология. 5-11 классы: программы для общеобразоват. учреждений к комплекту учебников, созданных под руководством В.В. Пасечника / авт.- сост. Г.М. Пальдяева. - М. : Дрофа, 2009. - 92, [4] c.

+ еще 83 источника

Примечания

Оригинал в pdf