«КОНСТИТУТИВНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ BnGSHW AtGSTFll В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ТАБАКА» - Дипломная работа

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 7

Глава 1. (ОБЗОР НАУЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ) 10

1.1. Стрессовые факторы 10

1.2. Окислительный стресс 11

1.2.1. Активные формы кислорода 12

1.3. Антиоксидантная система растений 14

1.3.1. Глутатион 15

1.3.2. Пролин 19

1.3.3. Супероксиддисмутаза 25

1.4. Повышения уровня стрессоустойчивости растений 28

1.4.1. Генно-инженерные стратегии для повышения стрессоустойчивости растений 30

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 32

2.1. Материалы исследования 32

2.2. Методы исследования 34

2.2.1. Агробактериальная трансформация листовых эксплантов табака 34

2.2.2. Стерилизация и выращивание семян трансгенных растений табака на селективной среде 36

2.2.3. Морфометрический анализ трансгенных растений табака 38

2.2.4. Выделение РНК и анализ содержания мРНК AtGSTF11 40

2.2.5. Биоинформатический анализ 40

2.2.6. Анализ активности супероксиддисмутазы, каталазы и содержания пролина в трансгенных растениях табака по гену AtGSTF11 41

2.2.7. Метод дидактической многомерной технологии (логико-смысловое моделирование) 42

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 44

3.1. Морфометрический анализ трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена BnGSH при нормальных условиях произрастания 44

3.1.1. Анализ длины корней трансгенных растений табака при выращивании на вертикально-ориентированных чашках Петри при нормальных условиях (+25°С) 44

3.1.2. Морфометрический анализ побега трансгенных растений табака 45

3.2. Морфометрический анализ трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена BnGSH при действии стрессовых факторов 46

3.2.1. Анализ роста корней трансгенных растений табака при выращивании на вертикально-ориентированных чашках Петри в условиях стресса 46

3.2.2. Морфометрический анализ побега трансгенных растений табака при действии стрессовых факторов 50

1.1. Определение профиля экспрессии гена AtGSTFll при действии стрессовых факторов на дикий тип A. Thaliana 55

3.4. Биоинформатический анализ гена AtGSTFll 54

3.5. Морфометрический анализ трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена AtGSTFll при нормальных условиях произрастания 58

3.5.1. Определение параметра роста корней трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена AtGSTF11 в нормальных условиях 59

3.5.2. Морфометрический анализ побега трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена AtGSTFll 59

3.6. Морфометрический анализ трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена AtGSTFll при действии стрессовых факторов 60

3.6.1 Анализ роста корней трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена AtGSTF11 при выращивании на вертикально-ориентированных чашках Петри в условиях стресса 60

3.6.2 Морфометрический анализ побега трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена AtGSTF11 при действии стрессовых факторов 62

3.7. Определение активности супероксиддисмутазы, каталазы и содержание пролина в трансгенных растениях Nicotiana tabacum L. по гену AtGSTFll 65

3.8. Обсуждение 67

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ПРОГРАММЕ ВЫСШЕГО УЧЕБНОГО ЗАВЕДЕНИЯ 75

4.1. Обоснование темы работы 75

4.2. Разработка лабораторной работы «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» 76

4.2.1. Теоретическая часть 76

4.2.2. Разнообразие и приготовление питательных сред 77

4.2.3. Гормональная регуляция в культуре клеток и тканей «in vitro» 81

4.3. Применение многомерных дидактических технологий в программе высшего учебного заведения 86

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 88

ВЫВОДЫ 89

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 90

Введение

Актуальность темы. Растения в процессе жизнедеятельности регулярно подвергаются множественным влияниям со стороны окружающей среды: засуха, засоление почвы, высокие температуры, холод и содержание тяжелых металлов в почве (Wise 1987).

Разного рода стрессовые факторы: засуха, холод, засоление,

затопление, токсические концентрации тяжелых металлов, воздействие критических температур, повышенное содержание озона, высокая кислотность или щелочность почв, дефицит элементов минерального питания и т.д. - уменьшают продуктивность сельскохозяйственных растений в два раза и более. Высокая интенсивность и долгая продолжительность действия абиотического стресса на растения могут привести к их гибели (Boyer 1982, Bray 2000). При воздействии на растения негативными факторами окружающей среды снижется скорость метаболических реакций, возникает окислительный стресс (Мерзляк 1989). Вследствие в растениях возрастает количество активных форм кислорода (АФК). Они в высоких концентрациях проявляют отрицательное влияние на процессы, которые происходят в клетках растений (Wise 1987).

Влияние абиотического стресса, спровоцированного данными условиями, ограничивает урожайность. Абиотический стресс инициирует изменения на молекулярном, биохимическом, физическом и морфологическом уровнях. Данные нарушения негативно действуют на развитие и рост растений (Wang 2013).

Исследование физических, биохимических изменений, которые происходят в клетках растений, при воздействии стрессовых факторов: например, сухой климат, повышенная температура, холод - является актуальным.

АФК возникают и в ходе клеточного метаболизма, однако в условиях стресса баланс между продукцией АФК и элиминацией нарушается. Избыточное количество АФК приводит к стремительной инактивации белковых продуктов в клетках растений, стимулирует перекисное окисление 7

липидов, нарушает синтез белков ДНК и целостность нуклеиновой кислоты, разрушает мембранные оболочки: в результате приводит к смерти клеток (Liu 2013).

В клетках растений происходит многоуровневая борьба с чрезмерным образованием АФК. Ступенчатая защита состоит в работе неферментативных антиоксидантных соединений и антиоксидантных ферментов (Wang 2013). Растения осуществляют контроль над АФК благодаря их детоксикации (Liu 2013).

Важными низкомолекулярными антиоксидантами считаются глутатион и аскорбат. Они участвуют в аскорбат-глутатионовом цикле, разрушая пероксид водорода (Бараненко 2006). Глутатион не только защищает клетки от повреждающего действия АФК, но и участвует в поддержании внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала и клеточном сигналинге (Noctor 2012).

Значимыми антиоксидантными ферментами являются

супероксиддисмутаза (СОД), глутатионредуктаза (ГР), каталаза (КАТ), аскорбатпероксидаза (АПР) (Бараненко 2006).

Целью данной работы являлся анализ трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. с конститутивной экспрессией таких генов, как AtGSTF11 A. thaliana и BnGSH Brassica napus L. при их произрастании в нормальных и стрессовых условиях.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. с конститутивной экспрессией таких генов, как AtGSTF11 A. thaliana и BnGSH Brassica napus.

2. Провести оценку параметров роста и стрессоустойчивости трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. конститутивно экспрессирующих ген BnGSH при действии стрессовых факторов.

3. Провести оценку параметров роста и стрессоустойчивости трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. конститутивно экспрессирующих ген AtGSTF11 при действии стрессовых факторов.

4. Определить уровень мРНК гена AtGSTF11 в растениях A. thaliana дикого типа в условиях засоления, засухи, гипотермии и тепла.

5. Провести анализ активности супероксиддисмутазы, каталазы и содержания пролина в трансгенных растениях табака по гену AtGSTF11.

Научная новизна: впервые проведена оценка параметров роста и стрессоустойчивости трансгенных растений табака экспрессирующих ген BnGSH. Зафиксировано увеличение роста растений при сверхэкспрессии данного гена при действии таких стрессовых факторов, как тяжелые металлы, засоление почвы, гипотермия и засуха. Впервые проведена оценка параметров роста и стрессоустойчивости трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена AtGSTF11. Определен профиль экспрессии гена AtGSTF11 при воздействии на растения A. thaliana дикого типа стрессовыми факторами.

Научно-практическая значимость работы: совокупность

результатов исследований помогут оценить вклад генов AtGSTF11 и BnGSH как одного из компонентов глутатионовой защиты в регуляции роста при изменяющихся условиях среды. Рассматривается потенциальная возможность использования его в качестве мишени для повышения продуктивности и стрессоустойчивости целых растений. В целом, испытанные в ходе работы генно-инженерные конструкции могут быть использованы для создания трансгенных культурных растений с повышенной продуктивностью и стрессоустойчивостью.

Выдержка из текста работы

Глава 1. РЕАКЦИЯ РАСТЕНИЙ НА АБИОТИЧЕСКИЙ СТРЕСС (ОБЗОР НАУЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Стрессовые факторы

Разного рода стрессовые факторы: засуха, холод, засоление, затопление, токсические концентрации тяжелых металлов, воздействие критических температур, повышенное содержание озона, высокая кислотность или щелочность почв, дефицит элементов минерального питания и т.д. - уменьшают продуктивность сельскохозяйственных растений почти в два раза. Высокая интенсивность и долгая продолжительность действия абиотического стресса на растения, в том числе и сельскохозяйственные, могут привести к их гибели (Boyer, 1982).

Засоление почвы может быть вызвано либо нарушениями природного характера, либо из-за ирригации. Наличие в составе почвы избыточного количества ионов Na, Ca или Mg, различного рода хлоридов, карбонатов, сульфатов является засолением. Если солей в почве выше 0,20-0,25 %, то говорят, что почва засоленная. По статистике уже через четверть века 30% наших земель из-за чрезмерного их засоления будут не пригодными для сельского хозяйства. Недостаток влаги ведет к уменьшению тургорного давления в клетках, тем самым ведет к закрытию устьиц, а далее к угнетению роста растения и снижению процента урожая. Действие негативных температур негативно влияет на всхожесть семян. Компоненты фотосистемы II, которые находятся в мембранах тилакоидов хлоропластов, повреждаются. Таким образом, активность фотосинтеза снижается: поступление углекислого газа нарушается, прекращается работа мембранного транспорта. Процесс синтеза АТФ и окислительное фосфорилирование также нарушаются. Рост активности протеаз ведет к уменьшению количества белков и увеличению низкомолекулярных продуктов, углеводный обмен также нарушается (Al- Khatib 1999).

Глобальное потепление усугубляют ситуацию. Сегодня засуха и стресс высоких температур являются злободневной проблемой для стран с умеренным климатом. Воздействия высоких температур, угнетает фотосинтез, нарушается нормальный рост растений, негативно влияет на накопление продуктов фотосинтеза. Для растений в состоянии стресса свойственен распад полирибосом, который нарушает синтез полипептидов. Образуются «стрессовые гранулы», которые приостанавливают синтез неспецифических белков и защищают матричную РНК от повреждающих стрессовых факторов. У растений из-за действия холода нарушается мембранный транспорт, нарушаются ферментативные реакции, падает скорость передвижения субстратов (Kratsch 2000).

Понижение температур от 20°С до 0°С уже считается абиотическим стрессом, которое может привести к замедлению процесса прорастания семян у растений, различным нарушениям развития цветков и плодов, снижает процент урожайности. При низких температурах растения гибнут из-за внутриклеточных и внеклеточных нарушений. Во время внутриклеточного охлаждение происходит активное формирование кристалликов льда в цитоплазме клеток растений, что нарушает их целостность и структуру. Внеклеточное охлаждение приводит к обезвоживанию цитоплазмы. В клетках растений происходит отток воды в межклеточное пространство по направлению к формирующимся кристалликам льда (Hasegawa 2000).

1.2. Окислительный стресс

Известно, что клетки растений постоянно поддерживают определенный баланс скоростей образования и разрушения АФК. В нормальных условиях их концентрация находится на низком уровне. Ухудшение условий существования сдвигает этот баланс в сторону повышенного образования АФК и накопления вызванных ими повреждений. Это неблагоприятное следствие, возникающее при действии на организм абиотических и биотических факторов, получило название окислительный стресс (ОС) (Blokhina 2003).

При всех абиотических стрессовых условиях растения претерпевают оксидативный стресс, связанный с усиленным образованием активированных форм кислорода. Эти формы кислорода образуются в различных субклеточных компартментах и реагируют с ДНК, липидами и белками. В нормальных условиях активированные формы кислорода эффективно детоксицируются при помощи ряда механизмов. Однако, если длительность стресса или его интенсивность превышают возможности системы детоксикации, происходит поражение клеток.

Ответом растительного организма на неблагоприятные воздействия окружающей среды является стресс (Бакулина, 2016). Неблагоприятными условиями окружающей среды считаются факторы: засуха, низкая температура, засоление почвы и др. Необходимое свойство живого организма - умение «защищаться» от данных стрессовых факторов. Изменения обмена растений, не нарушающие согласованности всех его функций, их глубина и быстрота, определяют устойчивость к стрессовым условиям.

Заключение

Конститутивная экспрессией гена глутатионсинтетазы рапса BnGSH способствует повышению продуктивности и стрессоустойчивости трансгенных растений табака в условиях засоления и действии кадмия, а также повышению продуктивности в нормальных условиях выращивания.

Конститутивная экспрессия гена AtGSTF11 в трансгенных растениях табака способствовала улучшению роста корней растений при засолении и гипотермии, а побега при нормальных условиях и действии засухи.

В трансгенных растениях табака при действии засухи зафиксированы более высокие уровни содержания пролина, активность

супероксиддисмутазы и каталазы, чем у дикого типа, что является биохимическим маркером повышения засухоустойчивости.

Наш анализ доказывает, что ген AtGSTF11 и ген BnGSH являются потенциальными мишенями в генной инженерии и геномном редактировании растений для целенаправленного изменения продуктивности и стрессоустойчивости целых растений.

Список литературы

1. Бараненко В. В.// Цитология. 2006. Т. 48, № 6. C. 465-474 Noctor G., Mhamdi A., Chaouch S., et al. Glutatione in plants: an integrated overview. Plant Cell Environ. 2012; 35: 454-484. doi: 10.1111/j.1365-3040.2011.02400.x

2. Бараненко, В. В.Супероксиддисмутаза в клетках растений / В. В. Бараненко // Цитология. - 2006. - Т. 48, № 6. - C. 465-473.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб.пособие.- М.: ФБК-ПРЕСС, 1991. - 160 с.

4. Власов Н.Ф., Зятчина Г.П. О сортовой специфичности изоферментов супероксиддисмутазы кормовыхбелков// Сельскохозяйственная биология. - 2000.- №5. - С. 93-96.

5. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений - Киев: Наукова думка, 1992.

+ еще 93 источника

Примечания

Оригинал в pdf